手把手教学｜细胞铺板

• 实验背景

细胞铺板是细胞培养中一项基础的实验操作，根据实验目的将一定浓度的细胞稀释液无污染地接种到在培养皿或培养板表面，以保证每个细胞都能获得相同的生长条件。以下是细胞铺板的详细操作步骤。

• 操作步骤

以T25瓶培养的贴壁细胞接种至孔板中为例：

1、准备工作

① 材料准备：显微镜、酒精灯、酒精棉球、移液枪、枪头、PBS液、胰酶、培养皿、血清、新鲜培养基、10 mL离心管、细胞培养皿、离心机等。

② 实验准备：实验前将实验所需材料放入超净台，提前30 分钟打开紫外灯灭菌，并37 ℃ 预热培养基、PBS 及胰蛋白酶。紫外照射 30 min 后，用含75% 的酒精棉球擦拭双手和超净台。在显微镜下观察细胞状态是否良好，细胞密度是否可以进行下一步操作。

2、细胞消化及制备细胞悬液

①  判断细胞状态可以进行下一步操作后，从恒温培养箱中取出细胞，置于超净台的无菌环境中。用移液枪尽量吸去培养基，沿T 25瓶内壁加入 5 mL PBS 液清洗2遍，四个方向充分晃动充分润洗后倒掉。

②  将500 µL 的0.25% 胰酶加入培养瓶内，上下左右铺匀后于37 ℃ 消化。当细胞由贴壁转变为半悬浮状态，即可终止消化。

③ 加入 4 mL 含 10% 血清的新鲜培养基，用移液枪反复吹打消化后的细胞使其脱壁并分散，制成均匀的细胞悬液，转移至 10 mL离心管中，1000 rpm 离心 5 min。

④ 弃上清，在10 mL离心管中加入 3 mL 10% 血清的新鲜培养基，吹打混匀细胞团后，完成细胞悬液的制备。

3、细胞计数与稀释

① 细胞计数：吸取15 μL细胞悬液与相同体积的台盼蓝染液混匀，沿盖玻片边缘将细胞悬液缓慢充满盖玻片和计数板之间。

② 稀释细胞：根据实验所需的铺板密度和细胞计数结果，计算稀释过的细胞悬液用量，剩余体积用细胞稀释液补充。

4、细胞铺板

① 在细胞培养板中加入一定量（一般是总量培养基的1/5）的培养基，放入孵箱中放置10-20 min。

② 从液面下吸取适量的细胞悬液，避免吸取气泡。

③ 将细胞悬液沿着孔边缘滴入，避免直接滴在中间位置。

④ 采用“8”字方法摇晃或“十字”形摇匀，重复5-6次使细胞分布均匀。

⑤ 将培养板放在台面上静置5 min，放回恒温培养箱。

• 常见问题：

1、细胞结团

① 细胞铺板的密度过大，细胞聚集。

② 铺板时没有摇匀或方法不适合，导致细胞沉降在一起，建议采用“8”字方法摇晃或“十字”形摇匀。

③ 细胞本身状态不佳，建议继续观察。

2、细胞铺板密度过大/过小

① 可能是细胞计数不准确，在计数前建议充分混匀。

3、铺板后细胞状态不佳

① 细胞密度太低，尚未适宜新环境，建议继续观察。

② 细胞消化时间过长，造成损伤，建议重新铺板。

③ 细胞污染，建议排查是否出现污染。

• 注意事项：

① 尽量将细胞吹打为单个，用移液枪充分吹打，使其均匀悬浮在培养基中。

② 在滴入细胞悬液和摇晃培养板时，要注意避免产生气泡，以免影响细胞分布。

③ 适当的细胞密度是保证细胞均匀分布的关键，过密容易造成细胞居中，过稀则会影响细胞生长。

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本文作者是"等等"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。

文稿：等等

校对：煲仔饭

素材：

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