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细胞与基因治疗领域 · 公众号 · · 2024-11-22 11:25

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慢病毒（Lentivirus）因其能有效感染分裂和非分裂细胞，免疫原性低、载体容量大、可稳定整合和持久表达等优势而在细胞疗法领域中广泛使用，在目前已上市的基于病毒载体的产品中，有16 款使用慢病毒载体。

重组慢病毒载体是一种由野生型人免疫缺陷病毒（Human Immunodeficiency Virus, HIV）改造而来的病毒系统，通过删除/失活与毒力、致病性、复制能力相关的基因元件，并将病毒基因组片段构建到不同的质粒上共转染包装细胞系（如HEK 293T）而包装出复制缺陷型慢病毒。重组慢病毒载体具备一次性感染能力，无复制能力，保障细胞治疗产品的安全性。

由于随机发生的同源或者非同源重组、回复突变等原因，慢病毒在包装/生产阶段可能产生可复制型慢病毒（Replication competent lentivirus，RCL），影响病毒载体的安全性。中国、美国及欧盟等监管机构相继出台指导性文件，要求建立灵敏可靠的方法对RCL进行控制检测。在本文中，我们将根据法规的要求，为大家分享RCL检测的法规要求、方法设计考量。

RCL检测法规要求

中国、美国及欧盟的监管机构均发布了指导原则，要求从病毒载体的设计上尽可能降低RCL的产生，同时，在产品的生产和应用的不同阶段进行RCL的控制，以保障患者用药安全。

表1 RCL 检测相关法规/指南汇总

RCL的监控策略

RCL 检测作为慢病毒载体质量研究和控制的重要项目，监管机构要求对稳转系统的主细胞库(MCB)、终末生产细胞(EOPC)、未经处理的慢病毒收获液(UPB)、慢病毒转导的细胞等不同阶段的样品进行RCL 检测，并对CAR-T细胞回输后的患者个体进行RCL监测。

若仅对DS进行RCL检测，而不检测UPB，中国和美国监管机构可能需要申报方提供纯化工艺不破坏RCL的证明，而欧洲药典会要求对纯化后的慢病毒载体进行RCL检测。

表2 不同样品阶段的RCL检测方法汇总

* 当未对MCB进行检测时

RCL的检测方法

RCL检测可分为快检法（如PCR法）和细胞感染检测两种方法，对于确证性临床阶段以及之后阶段的样品，则必须采用细胞感染检测法。细胞终产品因效期原因，细胞放行采用RCL快检法时，中国国家药品监督管理局药品审评中心（CDE）建议临床试验阶段或上市早期阶段用指示细胞培养法采用留样进行并行检测分析，积累数据；在上市后成熟阶段，留样可以作为必要时的研究分析。

1. PCR/qPCR法

基于PCR/qPCR法的快检法，是直接通过PCR/qPCR扩增待测样本中的RCL标志性序列，不涉及RCL在指示细胞中的扩增，检测耗时较短，但容易因样品中质粒残留导致假阳性，另外，因为RCL产生的机制较为复杂且具有随机不确定性，产生的RCL可能不具有PCR引物匹配的序列结构，导致产生假阴性，因此各监管机构均将细胞感染检测法作为RCL检测的金标准。

2. 细胞感染检测法

细胞感染检测法主要包括扩增阶段和指示阶段，将待测样本接种至敏感的指示细胞，通过细胞的多次传代培养，可能的RCL（即使起始量少）得到扩增，培养过程中观察细胞病变，培养结束后进行RCL相关标记物检测，如p24，gag，VSV-G。且经培养过程中的多次传代、清洗，样品残留得以去除，最大程度的降低了假阳性。

RCL检测方法要求较高的灵敏度，建立和验证RCL检测方法，需要使用阳控病毒来检验方法的灵敏度。由于慢病毒载体通常是基于HIV-1病毒骨架结构，监管机构鼓励阳控病毒的选择需在结构上能尽量代表生产中可能产生的RCL。同时，考虑到阳性病毒的生长特性、毒力和分析人员的安全性，法规一般建议选择 HIV 弱毒株或重组的条件复制型慢病毒载体作为阳性对照。如使用HIV弱毒株，则需要在BSL-3级生物安全实验室进行，若使用条件复制型HIV-1弱毒株，则可以在BSL-2级及以上生物安全实验室进行。

BSL-3级生物安全实验室的建设运营成本高，在中国的可及性难度较大，即使通过与其他单位合作，企业检测机构在项目管理和实验室管理方面也仍难满足cGMP要求。因此，采用条件复制型HIV-1弱毒株作为RCL 检测的阳性对照，可在BSL-2级生物安全实验室操作，则会大大降低RCL检测的执行和管理难度，更容易满足cGMP的各方面要求。

总之，RCL检测作为放行检测，需要按照GMP质量体系下对分析方法的要求进行方法验证和管理，相应的设施设备管理维护、人员培训也要符合GMP质量体系的相关要求。

药明生物安全性检测中心RCL 检测服务

RCL检测方法，尤其是作为金标准的细胞培养检测法，在灵敏度、检测量、阳控对照、质量体系、满足慢病毒载体产品快节奏的生产周期等方面具有严格的要求，以确保检测方法能够有效地识别可能存在的RCL，从而保证CGT 药物的安全性。因此RCL检测机构/实验室需要建立科学、符合法规的检测方法，并能提供灵活、快捷的检测安排。

为应对这些挑战，药明生物生物安全性检测中心凭借其强大的研发实力，成功建立了专业的RCL 检测平台。作为中国首个获得 FDA 方法备案，并通过EMA GMP认证的RCL检测机构 ，药明生物生物安全性检测中心在CGT检测领域展现了显著的优势。

设计的阳控病毒采用自主构建的 条件复制型HIV弱毒株（已获专利授权） ，可在BSL-2级及以上生物安全实验室进行，解决了三级生物安全实验室难以保障检测质量体系和项目管理复杂性的难题。同时也符合法规对阳控病毒设计的要求。
检测方法根据ICH, ChP和 USP要求进行了系统的方法学验证，包括培养全流程验证和两个终点检测的单点验证。
检测方法确定了能检测到1 TCID50阳控病毒时单个培养瓶的最大样本量，在实操层面能处理大体积的UPB检测。针对具体的检测样品，设定了满足GMP要求的样品适用性确认流程。无论是方法学验证还是日常检测管理均满足法规要求。

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