胰腺癌素有“癌王”之称，所过之处，九死一生。所以研究者们也在探寻它活动的蛛丝马迹（生物标志物），能够及时发现它的窝点和动向，便于迅速准确地出击。流调发现，我国的胰腺癌发病率越来越高，且有年轻化趋势。如果早发现、早干预，5年存活率能有所提高达到15%-25%。所以我们需要找到胰腺癌早期、特异性的生物标志物。
复旦大学附属上海市公共卫生临床中心的汪进教授，在刚刚结束的生物标志物与液体活检论坛上，向大家分享了他的研究团队在胰腺癌生物标志物方面的工作，给我们带来不少启示。
我们知道，胰腺癌的发病因素中，遗传物质的不稳定性有很大的关系，包括一些非编码RNA（ncRNA）的改变。而血循环中的外泌体携带有肿瘤相关的ncRNA，瘤抑制基因的功能，且在肿瘤细胞中有异常表达。汪教授的团队便考虑从外泌体中的ncRNA入手，寻找可用于液体活检的生物标志物。
研究组考虑了circRNA、lncRNA、microRNA，但因为circRNA在外泌体中含量很少，很难检出，而lncRNA需要扩增，提高了成本；microRNA（miRNA）除了避开以上两个缺点外，还有在血循环中稳定，不易被RNA酶降解的特性，为研究带来方便，所以最终选定了miRNA进行深入探索。
既然目标是无创或微创的液体活检，首先就会想到从临床上常用作检测标本的体液中寻找，主要是血浆、胰液、囊液，研究组就兵分三路，从这三种体液中寻找有意义的microRNA；第四第五路分别是meta分析和生物信息学。
汪教授的工作始于2009年，采用TaqMan探针法进行表达谱分析。研究组收集了49例胰腺导管癌（PDAC）和36例对照组血浆，分离出RNA进行检测，得到4个与对照组有明显差异的miRNA。
图A-D分别为miR-21、miR-210、miR-155和miR-196a在对照组和PDAC组的FoldChange
接下来对这4个microRNA做了ROC曲线，计算AUC，评价其诊断效率。它们单独使用的AUC在0.62-0.69之间，而联合应用的AUC能达到0.82，有了显著的提高。
A-D分别为4个microRNA的ROC曲线，E为联合应用的ROC。
此后为了进一步证实其临床应用价值，又扩大样本量做了双盲实验，4个microRNA联用的为0.75，若加上传统的CA 19-9，则能达到 0.93。
从胰液中寻找标志物时已是2014年，此时已经有了研究基础，便能拿到更多的研究经费，可以做用更高大上的微阵列方法了~该研究纳入88位患者，分为训练集（training set）和验证集（validation set）。
训练集有PDAC组6个样本，对照组为来自6个非胰腺疾病、非健康患者（non-pancreatic, non-healthy, NPNH）的2个混合样本。收集胰液做了miRNA微阵列，对Fold Change在1.5以上的49个miRNA做了层次聚类分析，找到4个有价值的miRNA，包括原来报道过在PDAC组织中过表达的miR-205和miR-210，还有未报道的miR-1247和miR-492作为新发现的标志物。
用qRT-PCR对这4个候选miRNA进行了初步验证，PDAC组和NPNH组有明显差异。接下来就要在更大的验证集中进行验证。验证集包括PDAC组44例，CP（慢性胰腺炎组）19例，NPNH组13例。
图为4个miRNA在各组的Fold Change，虽然有些miRNA的CP组和PDAC组差异不明显，但和对照组还是有显著差异。
当然还是要作ROC曲线来评价它们鉴别PDAC和NPNH的效率。除了4个microRNA，也同时做了CA 19-9，以及5者联用的ROC曲线。惊诧的发现，5者联用可使特异性达到100%，AUC也达到了0.99，而4个miRNA联用的AUC为0.92。
A：4个microRNA、CA 19-9以及联合应用的ROC；B：绿色为miR-205和miR-210同时高水平（中值或以上）的患者的总体生存曲线，蓝色为二者非同时增高（即只有一个高或两者都不高）的患者的生存曲线。可见此二者联合应用有判断预后的意义。
做囊液中标志物的搜查时，应用了二代测序（NGS）进行分析。为了早期诊断两种癌前病变的恶化，即胰腺导管内乳头状黏液肿瘤（IPMN）和胰腺囊液性粘性肿瘤（MCN），研究组选取了17例患者，分为低风险组（低/中级异型的IPMN和MCN）6人，高风险组（高级异型）8人，胰腺腺癌（PA）组3人。
先从2个低风险组和2个高风险组样本中检测出13个在高风险组上调的miRNA，2个下调。不过样本量太少，经过伪发现率（FDR）校正后，并不是所有miRNA的差异都有统计学意义。
再用qRT-PCR在所有17个样本中验证miR-216a和miR-217这两个有肿瘤抑制作用的miRNA。结果miR-216a在低风险组 vs 高风险组、低风险组 vs 胰腺癌组有显著差异，而高风险组vs 胰腺癌组则没有差异。这也说明它有潜力区分良性和高风险的癌前病变。miR-217在三组中没有差异，只是有相似的趋势，扩大样本量也许会出现更清晰的结果。
这倒是一个有意思的现象。miR-216a和miR-217据报道在肿瘤组织中是低表达的，本研究确实观察到它们在囊液中表达增高，也经过了qRT-PCR的验证。这是为什么呢？研究组百思不得其解。会不会是肿瘤组织排出来了？还是其他什么机理？可能需要进一步研究。
最后，汪教授还特别鼓励学生利用网络上已发表的成果进行二次分析，即meta分析和生物信息学方法。Meta分析可以通过质控将零散的数据汇总成更大的数据集，得出更有说服力的结果；而生物信息学分析就像投资前的调查，找到最有投资（分子生物实验）价值的分子。
这是2017年做的meta分析，纳入了29个关于胰腺癌与miRNA的研究，做了SROC（summary ROC）曲线，AUC为0.89。
A：总ROC；B：Deek发表偏倚检测。
生信方面，这篇2016年的文章挖掘了GEO、Oncomine两大数据库中关于胰腺癌与miRNA和mRNA的数据。
从GEO中提取了5个miRNA表达谱数据集，用其中的2个发现集（discovery set）做个交集，得到26个共有的差异表达的miRNA（图A），然后在3个验证集中进行确认（图B）。图C是这些miRNA的表达情况。
然后从Oncomine数据库中找到5个关于胰腺癌和基因表达（mRNA）的研究的数据集，把它们的异常表达基因也做个交集，得到260个共同的差异表达基因。
A：上调的有212个；B：下调的有48个。
接着做了IPA通路分析，找到这26个miRNA是靶向260个基因中的53个，接着对这53个基因进行网络与途径分析，发现它们参与胰腺癌相关的4个基因网络和5个经典途径，进一步求证了它们作为胰腺癌生物标志物的可行性。
研究组还做了文献回顾，发现这些基因所编码的蛋白中，有6个会分泌到血浆或血清中，更有发展为液体活检生物标志物的潜力。这样通过生信工具来找下一个研究目标，不就省事多了~
不过这篇生信的文章有点遗憾，忘了感谢NIH的资助，还把作者写漏了，只好撤了……
参考文献：
MicroRNAs in Plasma ofPancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients as Novel Blood-Based Biomarkers ofDisease
Circulating microRNAs inPancreatic Juice as Candidate Biomarkers of Pancreatic Cancer
Next generation sequencing ofpancreatic cyst fluid microRNAs from low grade-benign and high grade-invasivelesions
Clinically relevant circulatingmicroRNA profiling studies in pancreatic cancer using meta-analysis
Retracted: Identification ofNovel Biomarkers for Pancreatic Cancer Using Integrated Transcriptomics WithFunctional Pathways Analysis
