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利用CRISPR-Cas13 mRNA靶向编辑巨噬细胞对肌腱损伤进行免疫治疗

BCML速递 · 公众号 · · 2024-08-27 22:00

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组织修复微环境由多种免疫细胞、基质细胞和成纤维细胞组成。修复的初始阶段是由强烈的组织炎症引发的，其中巨噬细胞充当急性炎症反应的引发剂。它们释放大量影响生物体再生的细胞因子。由分泌磷蛋白 1 （ SPP1 ）编码的骨桥蛋白（ OPN ）是一种具有细胞因子样功能的基质细胞蛋白，与急性炎症有关，并控制组织修复和纤维化之间的平衡。巨噬细胞衍生的 SPP1 已被证明在各种疾病急性期的发生和进展中发挥着关键作用。抑制 SPP1 可有效减轻肝纤维化、心脏修复、多发性硬化症、乳腺癌和其他疾病。因此，抑制巨噬细胞 SPP1 有潜力作为治疗肌腱损伤急性炎症期的新策略。

目前靶向 SPP1 的方法主要涉及小分子抑制剂。然而，由于结构简单，抑制剂表现出低特异性，可能与多个靶点相互作用，降低了抑制效率。作为高效 RNA 编辑工具， CRISPR-Cas13 系统源自原核生物针对入侵病毒的防御机制，可有效切割外源 RNA 。因此，利用 Cas13 系统在转录后水平直接破坏巨噬细胞中的 SPP1 ，可以有效抑制损伤引发的 SPP1 过表达，避免 RNAi 潜在的脱靶效应。

基于此，上海交通大学附属第六医院的刘坤教授团队和上海交通大学医学院附属瑞金医院的王非教授合作研究了一种基于 Cas13 系统的递送平台。其将 Cas13 核糖核酸 - 蛋白质复合物（ RNP ）封装在巨噬细胞靶向的阳离子纳米簇中，形成靶向纳米簇，精准递送至巨噬细胞进行瞬时转染，实现炎症期巨噬细胞特异性靶向。这种纳米簇被纳入聚己内酯（ PCL ）电纺纳米纤维上的 ROS 响应水凝胶中，以实现按需释放。这种新策略快速有效地抑制巨噬细胞中的靶基因，为解决巨噬细胞引发的急性炎症提供了平台（图 1 ）。

纳米颗粒在体内的命运与其纳米特性密切相关。聚合物纳米粒子的合理设计，特别是其表面电荷密度和靶向目标的匹配度，可促进巨噬细胞内化。为了构建适合将 Cas13 RNP 递送到巨噬细胞中的靶向纳米簇，研究者合成了具有不同缀合比例的苯基硼酸（ PBA ）改性支链聚乙烯亚胺（ bPEI ）（ PEI-PBA, P ）和 4- 异硫氰酸苯基 -α-D- 吡喃甘露糖苷（ Man ）改性的 bPEI （ bPEI-Man, M ）。对纯化的 bPEI-PBA 、 bPEI-Man 和 bPEI 使用 1H 核磁共振（ 1H NMR ）谱进行表征，结果表明 bPEI 缀合物合成成功，包括 bPEI-PBA1 （ P1 ）、 bPEI-PBA2 （ P2 ）、 bPEI-Man1 （ M1 ）和 bPEI-Man2 （ M2 ）（图 2 ）。研究者测量了纳米簇的流体动力学尺寸、多分散指数（ PDI ）和 zeta 电位。所有 P/M 纳米簇均显示出 4.21 至 36.20 mV 范围内的正表面电荷（图 2c ）。随着 P/M 重量比降低，纳米簇的流体动力学尺寸和 PDI 增加。随后，研究者采用稳定表达绿色荧光蛋白的 Raw264.7 细胞作为模型来评估 Cas13 RNP P/M 纳米簇的敲低效果。 GFP 引导 RNA （ gRNA ）与 Cas13 蛋白结合形成 RNP ，与 P/M 纳米簇混合。 P1/M1 表现出最高的递送效率，因此选择表现出高均匀性和击倒效率的 P1/M1 纳米簇进行进一步研究。为了评估巨噬细胞靶向性，将不同 P1/M1 质量比的纳米簇与 FAM 标记的 Cas13 RNP 组合，形成转染纳米颗粒（ P1/M1-Cas13 RNP ）。随后，研究者使用流式细胞术检查了 Raw264.7 细胞中这些纳米颗粒的细胞摄取情况。质量比为 3:1 和 2:1 的 P1/M1 纳米簇在巨噬细胞中表现出最佳的细胞摄取效率，而当 P1/M1 比率为 1:1 、 1:2 和 1:3 时，巨噬细胞摄取效率以剂量依赖性方式降低。为了在靶向性和均匀性之间取得平衡，研究者选择了 3:1 的 P1/M1 比率来承载 Cas13 RNP 系统。通过透射电子显微镜（ TEM ）图像评估 P1/M1 纳米簇和 P1/M1-Cas13 RNP 纳米粒子的微观结构（图 2e 、 f ），结果表明， P1/M1-Cas13 RNP 纳米颗粒的尺寸（ 321.5±41.6 nm ）比 P1/M1 纳米簇（ 258.7±52.0 nm ）显着增加。对于 Cas13 RNP 递送，研究者制备了负载有不同质量比（ 0 、 0.5 、 1 、 2 、 4 和 8 ）的 Cas13 RNP 的 P1/M1 。增加 P1/M1 纳米簇的数量导致蛋白质的电泳迁移率逐渐降低，表明复合物逐渐形成（图 2i ）。随后，研究者研究了在最佳条件下使用 P1/M1 纳米簇转染 Cas13 RNA 的效率。如图 2g 所示， P1/M1-Cas13 RNP 纳米颗粒在 Raw264.7-GFP 细胞中表现出高 GFP 敲低效率（约 90% ）。此外， P1/M1-Cas13 RNP 转染细胞的荧光强度优于商品化的 Lipofectamine CRISPRMAX （ Lipo CM ）和非靶向的 P1 ，流式细胞术显示阳性细胞率（ FAM 标记 Cas13 转染的细胞）也显着高于其他组（图 2h ）。这些都表明 P1/M1-Cas13 RNP 纳米簇表现出高效的敲降效率和巨噬细胞靶向性，可作为巨噬细胞 mRNA 治疗的优异 Cas13 RNP 递送载体。

如示意图所示（图 3a ）， HA-PBA 的 PBA 部分通过酰胺键连接到 HA 主链上。 NMR 光谱分析证实了 HA-PBA 的成功合成（图 3b ）。 ROS 响应性水凝胶通过 HA-PBA 和 PVA 溶液之间的快速凝胶化和交联形成的，并通过硼酸酯动态键来加强（图 3c ）。将 HA-PBA 和 PVA 溶液混合后，储存模量（ G' ）和损耗模量（ G’’ ）随着时间的推移而增加，在约 20 秒时达到相等，证实了 HA-PBA/PVA 凝胶的成功从液体转变到水凝胶。在应变扫描过程中（约 0.1-100% ），水凝胶保持凝胶状粘弹性状态。然而，随着应变增加至 1000% ， G' 减小并变得小于 G'' ，表明 HA-PBA/PVA 水凝胶的剪切稀化特性（图 3d ）。通过循环应变变化（ 1 ％或 1000 ％）评估水凝胶的触变特性。如图 3e 所示，水凝胶在高应变（ 1000% ）下破裂并在低应变（ 1% ）下恢复到凝胶相。此外，水凝胶中 P1/M1-Cas13 RNP 的存在增加了其模量（图 3f ）。将水凝胶切成两片会导致新切割的表面重新接触并逐渐融合，形成完整的水凝胶，而不受外界影响，证明了其自修复特性（图 3g ）。这些结果表明 HA-PBA/PVA 水凝胶具有可注射和自修复的特性。 H2O2 是 ROS 的主要组成之一，可引发水凝胶中 P1/M1-Cas13 RNP 的 ROS 响应性释放。与初始状态相比，水凝胶的扫描电子显微镜（ SEM ）图像显示用 H2O2 处理后其具有更高的孔隙率（图 3h ），并降低了其模量（图 3f ）。更重要的是，水凝胶中的药物释放遵循典型的双相释放曲线（短期快速释放和长期持续释放）。在 H2O2 存在下， P1/M1-Cas13 RNP 的释放明显增加（图 3i ）。相反，在没有 H2O2 的情况下，水凝胶中药物仅释放 28.8% ± 1.3% 。这些结果表明 ROS 水平增加，硼酸酯被破坏，导致水凝胶网络受到侵蚀，药物释放增加，在炎症阶段很好地适应了免疫微环境，按需释放 P1/M1-Cas13 RNP 。

为了实现向腱周组织的靶向释放并尽量减少对内源性肌腱愈合的影响，研究者将负载 P1/M1-Cas13 RNP 的 HA-PBA/PVA 水凝胶与电纺膜结合起来形成 HE 贴片。将贴片放置在 Transwell 上室中，水凝胶侧位于下室中，并在下室中用 LPS 刺激巨噬细胞，以模拟体内急性炎症微环境，诱导巨噬细胞产生 SPP1 。与没有纳米颗粒的组相比， P1-Cas13 RNP@HE 和 P1/M1-Cas13 RNP@HE 组中巨噬细胞产生 SPP1 的速率、转录水平和 SPP1 的释放均下调。此外，与 P1-Cas13 RNP@HE 相比， P1/M1-Cas13 RNP@HE 在敲低 SPP1 方面表现出更高的效率（图 4a-f ）。然而， SPP1 在巨噬细胞和成纤维细胞之间串扰中的作用仍不清楚。研究者选择 NIH/3T3 胚胎成纤维细胞作为静息态细胞，并与处理过的巨噬细胞上清液一起培养 24 小时。如图 4g-o 所示，成纤维细胞活化程度和迁移能力随着 SPP1 释放的减少而降低，其中 P1/M1-Cas13 RNP@HE 的影响最显著。此外， P1/M1-Cas13 RNP@HE 还可减少肌成纤维细胞分泌的粘附相关生物标志物（包括 Col I 和 III ）。

植入防粘连膜是肌腱粘连的常见临床治疗方法，但它主要起到物理屏障的作用，生物活性有限。因此，研究者在肌腱损伤后的缝合部位周围植入 P1/M1-Cas13 RNP@HE 补片，以评估其抗粘连特性。如图 5 所示，在对照组和 HE 组中，由于肌腱修复区域和腱周组织之间形成致密的粘连组织，镊子无法穿透。相比之下，负载 Cas13 RNP 的纳米簇可有效降低粘附力，从而轻松实现钝性分离。此外， P1/M1-Cas13 RNP@HE 组比 P1-Cas13 RNP@HE 组表现出更少的粘附和更平滑的形态，表明 SPP1 的巨噬细胞靶向干预可以更有效地减少粘附形成。再生肌腱部位的组织学切片用苏木精和伊红（ HE ）和马森三色染色揭示了肌腱粘连的结构特征，包括细胞外基质沉积、腱周间隙不连续性和纤维排列紊乱。在 P1-Cas13 RNP@HE 和 P1/M1-Cas13 RNP@HE 组中观察到最佳纤维排列，修复部位和腱周组织之间的生理间隙变得更加清晰。为了研究 P1/M1-Cas13 RNP@HE 是否对肌腱再生产生不利影响，研究者记录了修复肌腱的刚度和载重负荷（图 5h 、 i ）。生物力学结果表明四组之间的机械强度或刚度没有显着差异。研究者还评估了粘附相关蛋白的变化，结果显示 P1/M1-Cas13 RNP@HE 显著降低了 Col I 、 Col III 和 α-SMA 的表达。 RT-PCR 和酶联免疫吸附测定（ ELISA ）结果进一步表明 P1/M1-Cas13 RNP@HE 具有优异的治疗效果，表明其通过早期炎症干预在抑制肌成纤维细胞转化和粘连组织中 Col 沉积方面发挥着重要作用。

为了揭示 P1/M1-Cas13 RNP@HE 的抗粘附机制，研究者在术后 3 天对对照组和 P1/M1-Cas13 RNP@HE 组进行 RNA 测序，以确定 SPP1 的下游通路。 PCA 证明了组内偏差的适当一致性，支持了 RNA-seq 结果的合理性。与对照组相比， P1/M1-Cas13 RNP@HE 组中鉴定出 143 个上调基因和 240 个下调基因（图 6a-c ）。 GO 富集分析表明差异表达基因（ DEG ）主要与细胞迁移、粘附和定位相关。此外， KEGG 分析显示， P1/M1-Cas13 RNP@HE 治疗增强了细胞因子 - 细胞因子受体相互作用、 ECM 受体相互作用和 PI3K-AKT 通路（图 6d ）。为了阐明 SPP1 的下游受体，研究者根据 STRING 数据库获得了 10 个相关基因，并根据 p 值 <0.05 和 |log2FC| 的 DEG 阈值筛选了 CD44 和纤连蛋白 1 （图 6e 、 f ）。通过蛋白质 - 蛋白质对接证明 SPP1 通过氢键对 CD44 具有更大的亲和力，这表明 SPP1 可能通过与 CD44 结合来促进成纤维细胞活化（图 6g ）。同时，使用免疫荧光和蛋白质印迹观察到肌成纤维细胞中 CD44 表达升高（图 6j-m ）。这表明 SPP1 表达的减少归因于 Cas13 RNP 能够精确识别 SPP1 mRNA 序列以在 gRNA 引导下进行剪切，而不是非特异性识别。因此， P1/M1-Cas13 RNP@HE 通过抑制 SPP1/CD44 通路来抑制产生 SPP1 的巨噬细胞和肌成纤维细胞的活化。

为进一步研究驱动 SPP1 诱导 CD44 表达增加的潜在机制，研究者在体外将 SPP1 引入 NIH 3T3 细胞并进行转录组分析。结果显示 AKT 表达显着升高， PI3K-AKT 通路中 DEG 的功能丰富（图 7a-c ）。结果显示 CD44 可能通过介导 AKT 磷酸化，促进成纤维细胞活化，提高其自身的表达。实验测定证实，过度的 SPP1 与 CD44 受体的结合增强了 AKT 磷酸化，从而提高了成纤维细胞中 CD44 的表达。这建立了有助于肌成纤维细胞转化的 CD44/AKT 正反馈调节途径（图 7d 、 e ）。这一机制强调了 P1/M1-Cas13 RNP@HE 通过巨噬细胞靶向和高效敲低能力减轻腱周组织粘连的治疗潜力。基于这一机制，研究者对 FDA 批准的对 SPP1 具有潜在直接影响的小分子药物进行了虚拟筛选和实验验证。与 OPN 抑制剂相比，辛伐他汀成为对 SPP1 具有最强结合亲和力的化合物。随后，研究者在 SPP1 存在的情况下用不同浓度（ 0 、 0.5 、 1 和 2 µm ）和持续时间（ 0 、 12 、 24 和 48 小时）的辛伐他汀处理 NIH 3T3 细胞。结果表明，时间和浓度对成纤维细胞增殖产生渐进影响。辛伐他汀有效抑制成纤维细胞转化为肌成纤维细胞和 Col 沉积。辛伐他汀具有广阔的临床应用前景，其抗粘连和抗纤维化机制值得深入探索。

综上所述，这项研究证实，巨噬细胞分泌的 SPP1 在早期组织损伤期间作用于成纤维细胞的 CD44 受体，触发下游 AKT 磷酸化，导致 CD44 表达增加、肌成纤维细胞分化和 Col 沉积。研究者通过开发了 P1/M1-Cas13 RNP@HE 作为 Cas13 RNP 传递的有效平台，调节免疫微环境以达到防粘连的目的。 P1/M1-Cas13 RNP@HE 表现出 ROS 响应性、巨噬细胞靶向性、高效敲低和低细胞毒性，为肌腱损伤的治疗引入了一个新颖且有前景的平台。

本研究由上海交通大学附属第六医院的刘坤教授团队和上海交通大学医学院附属瑞金医院的王非教授合作完成，并于 2024 年 3 月发表于 Advanced Materials 。

论文信息： Wang S, Xiao Y, Tian J, Dai B, Tao Z, Liu J, Sun Z, Liu X, Li Y, Zhao G, Cui Y, Wang F*, Liu S*. Targeted Macrophage CRISPR-Cas13 mRNA Editing in Immunotherapy for Tendon Injury. Adv Mater 2024 , 36（19）: e2311964.

供稿：季威

审校：孙亨

编辑：许梦平