在确定最佳反应条件后，作者首先探索了电化学简单二肽的C-N键断裂适用范围（图 2）。多种天然脂肪族氨基酸（如亮氨酸 (Leu)、丙氨酸 (Ala)、缬氨酸 (Val)、苏氨酸 (Thr)、甘氨酸 (Gly) 和谷氨酸 (Glu)）以及非天然药用大分子氨基酸（如L-叔亮氨酸、L-烯丙基甘氨酸、L-环己基甘氨酸和环亮氨酸）都能成功地应用于该电化学开环反应，以中等至良好的产率获得二肽醛（
1b
-
14b
）。单晶X射线衍射进一步明确证实了
11b
的结构。此后，该团队探究了携带多种氨基酸残基的三肽（
15b
-
22b
），电化学开环转化的稳定性体现在能耐受包括烯类和炔类在内的官能团，这些基团可作为后期生物偶联反应位点。更重要的是，含有富电子的苯丙氨酸残基在电解条件下依然是兼容的，而包含这类结构的三肽底物在直接电化学条件下通常比较容易分解。令人欣喜的是，直接电化学合成肽醛的策略可以顺利对含
L-烯丙基甘氨酸的四肽和五肽进行转化，进一步印证了该反应具有很好地生物兼容性（
23b
-
25b
）。此外，经过优化的电合成方法还能耐受多种常见的酰胺基和酯基底物，尽管这些底物都带有异丙基、叔丁基、环己基、金刚烷基或直链烷基（正丁基），包括供电子基（-OMe）和缺电子基（-CO
2
Me、-CF
3
、-CN）及活性高的合成片段（烯基、炔基等）（
26b
-
44b
）。不仅如此，开发的方法还成功地对市售药物普瑞巴林的主要成分结构进行了开环，以中等产率得到了ε-氨基醛衍生物
35b
，进一步说明了该方法的实用性。此外，通过DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）自由基清除活性测定评估了醛产物的抗氧化活性，其中一定浓度的
21b
、
22b
和
24b
表现出温和的抗氧化活性。
图2. 肽、酰胺和酯的电化学开环底物适用范围
（来源：
Nat. Commun.
）
在对多种氨基酸寡肽进行C-N键开环反应后，作者继续试图通过官能团转化来探究肽醛产物的合成应用（图3）。首先电解了5.0 mmol的二肽底物
1a
，得到了相应的肽醛
1b
，收率为72%，发现产率没有明显下降。进一步地，五种新型多肽序列（
45
-
49
）都是由
1b
通过简单的步骤快速构建，这显示了该反应在实现预组装多肽体系中的天然氨基酸残基多样化修饰的潜力，包括非天然氨基酸（UAAs）的合成。引人注目的是，一系列多肽偶联药物（PDC）（
50
-
56
）可以通过胺化或酯化与市场上销售的药物进一步组装。
图3. 醛肽的衍生化反应
（来源：
Nat. Commun.
）
环肽化合物在非核糖体肽合成酶（NRPS）的天然产物中十分常见，由于其对酶降解的稳定性高、受体选择性强以及药代动力学特性良好，因此被视为治疗罕见病的候选药物。该团队试图从简单的高脯氨酸残基开始，通过在肽中快速引入新官能团，高效地构建扩展大环。值得一提的是，烯烃和羧酸衍生的二肽（
48
和
49
）以及三肽醛（
22b
）可以通过关键的烯烃复分解反应、锰催化的C-H炔基化反应和点击反应实现，以简洁的合成序列快速转化为分别含有(
E
)-烯（
58
）、酰胺（
59
）、炔（
60
）以及三氮唑（
61
）连接的大环（图4）。事实证明，在订书肽类结构的连接区嵌入特殊官能团会影响所得产物的生物特性，作者之后利用电氧化策略能够快速合成一系列功能和结构丰富的分子，从二肽醛
1b
合成的小型化合物库就是一个例子。
图4. 环肽的合成
（来源：
Nat. Commun.
）
鉴于电化学开环反应的简洁性，作者进一步探究了该反应的机理。首先在
H
2
18
O 存在的条件下进行同位素标记实验，结果表明新形成的醛的氧原子来自同位素标记的水（图5a）。另外，使用同位素标记的D
2
O为溶剂进行实验揭示了一个简便的C-H活化步骤，醛的α-位上的H/D证明了这一点（图6b）。此外，对伏安图结果的分析表明，二肽
1a
在大约1.928 V的电压下发生阳极氧化（参比电极Ag/AgCl），而
1b
没有观察到明显的氧化峰，这表明醛
1b
在标准条件下很难进一步氧化成酸
49
（图
6c）。这一结果为反应体系中没有羧酸产物提供了合理的解释，即使使用较大的电流依然如此。此外，经过通/断电研究后发现该反应通过自由基链式反应的可能性很低
（
图
6d）。
图5. 反应机理验证
（来源：
Nat. Commun.
）
此外，为了进一步阐明反应机理，作者与南开大学仇友爱教授课题组合作开展了相关理论计算。以
63a
为模型底物进行了DFT计算（图6）。
63a
可能首先经历两步单电子氧化，然后出现亚胺中间体正离子
Int3
。根据
TS2
的势能面，
Int3
中间体捕获一分子H
2
O（ΔG = 8.98 kcal/mol，ΔG* = 14.70 kcal/mol）。在生成的
Int5
中，发现一个O-H-O分子内氢键稳定的中间体，而
Int3′
捕获水分子产生的类似中间体却无法找到。以
n
Bu
4
NHSO
4
中的HSO
4
-
为布朗斯特碱，生成的
Int5
可以无障碍地去质子化生成
Int6
，并通过
TS3
再质子化为
Int7
，消耗3.32 kcal/mol的能量。由于能垒较低，质子转移是一个快速过程。在
Int7
中发生
C-N键断裂，通过
TS4
产生12.12 kcal/mol的能垒，生成质子化产物
Int8
，该产物可能与HSO
4
-
结合生成
Int9
。此外，作者还考虑了另一种途径，即通过
TS5
在
Int6
中发生C-N键断裂，生成类似烯醇的产物。然而，由于能垒（26.72 kcal/mol）太高，可能性不大。
图6. DFT计算
（来源：
Nat. Commun.
）
根据不同保护基的实验现象，作者计算了N-酰基上连接Boc、Bz和Cbz基团相应中间体和过渡态的相对吉布斯自由能。结果列于图7。在每个变化中，
Int3
都被选为能量零点。其中，r是Int3转化为产物形式的反应速率，kobs表示观察到的速率常数，kB是玻尔兹曼常数，T = 298.15K，h是普朗克常数， 是气体常数，[H
2
O]是水的浓度，
c
(Int3)是亚氨基中间体
Int3
的分析浓度。对于N-酰基的各种变化，
TS4
和
Int3
之间的自由能差在决定反应活性方面起着关键作用。利用图7中的DFT计算数据，不同的N-酰基具有不同的kobs。在Boc、Bz、Cbz和Piv取代的环胺中，
Piv取代的环胺反应速度最快
（8.9×10
-2
L/mol
-1-
s
-1
），但加入一个氧原子后（Boc取代的环胺），kobs显著下降到7.2×10
-7
L/mol
-1-
s
-1
，这意味着反应活性相对较低。
图7. 不同保护基的相对吉布斯自由能
（来源：
Nat. Commun.
）
小结：
阮志雄团队首次报道了一种电化学脯氨酸肽的环胺开环反应，通过温和且生物兼容性较好的反应条件（涉及C-N键断裂）直接合成非天然肽醛和远端氨基醛。该策略可快速获得多种具有潜在抗氧化活性的肽醛，并扩大了底物范围，包括酰胺、酯和含不同特殊官能团的高脯氨酸肽。
发展的电化学开环方法可以在无消旋化条件下实现高效修饰和组装线性肽和环肽。
此外，实验和DFT计算表明，
不同N-酰基保护基在该反应体系中起着决定性作用
。
