材料表面的微图案结构具备仿生性能，可模拟细胞外基质、诱导细胞行为，已被广泛研究。但是，如何获得用于骨修复再生的内部稳定可控的微图案三维支架仍是一大挑战。
广东省科学院生物与医学工程研究所许为康团队
利用3D打印结合软光刻技术制备出具备规整光栅阵列的PCL片层支架，通过层层堆叠、局部高温点焊接的方式
获得了内部具有可控光栅结构的三维支架。研究光栅阵列微图案对BMSCs增殖分化的影响，以及调控巨噬细胞向M1或M2极化的能力
。
1、主要内容
图1 材料的表面形貌
相比Flat组，G20组和G30组具备规整的光栅阵列结构，光栅表面没有明显的缺陷以及杂质。G20、G30组的光栅间隔尺寸大小分别为 21.60±0.56um、30.76±0.72um，槽脊（光栅条平面）宽度基本一致。这表明利用热熔融压印的方法不同尺寸的光栅阵列微图案在PCL材料上成功制备。不同尺寸的光栅阵列影响PCL材料的表面纳米形貌，可知表面制备微图案的材料与表面光滑的材料表面纳米层面上的形貌和粗糙度相近，而不同微图案之间的纳米形貌和粗糙度几乎一致。这表明不同微图案表面在纳米层面上的差异性远小于在微米层面上的，突出了我们制备材料工艺的稳定性，符合微米级尺寸差异的设计构思。
在支架的表面微形貌观察中，Flat组支架表面形貌平坦光滑，支架的侧面同样如此，支架层间连接处仅热熔处出现熔融粘合。
G20组支架表面和侧面形貌可以清晰观察到不同支架片层间纤维表面，光栅阵列结构良好，支架制备过程中通过高温点热熔方式连接支架片层不会大面积破坏支架表面结构，仅在连接部位熔融粘合
。这表明，我们成功制备了具有可控微图案的三维支架。
图2 Falt、G20、G30组材料促BMSCs增殖活性
在第1天，光栅组BMSCs的增殖活性略显著于Falt组，而G20组OD值要稍高于G30组。第3天三组的OD值无显著差异，这与活死染色的结果相符，三组的活性细胞数量（绿色荧光)相差不大，几乎无死细胞（红色荧光）。值得注意的是，
相比于Falt组BMSCs杂乱无章的排列，光栅组的BMSCs增殖沿着光栅走形分布，这进一步表明，具有表面微图案的材料可调控细胞生长行为
。各组细胞增殖随着培养时间的增加而增加，各组差异中第5天与第1天一致，但是，到了第7天，光栅组调控BMSCs增殖的速度明显加快，G20组最显著。
与Flat和G30组相比，G20组含光栅微图案，且光栅间距最小，其表面粗糙度最大，最有利于细胞的粘附和增殖。
图3 Falt、G20、G30材料促BMSCs成骨分化
在成骨分化早期，光栅组和Flat组相比，只有G20 组的成骨基因（RUNX2、COL1和ALP）的表达表现出显著上调。G30组仅ALP基因表达出显著上调，COL1、RUNX2基因的表达显著低于Falt组。在第14天，G20在各个基因表达中均显著高于其余两组。在ALP表达中Falt组明显上调，但仍略低于G30组，而COL1基因的表达两组无显著差异。G30组RUNX2的表达在第14天显著上调，高于Falt组。ALP、茜素红染色和定量趋势一致。综合来说，
相比平面组，具有光栅阵列微图案的PCL能显著促进BMSCs的成骨分化，以G20组最佳。
图4 Falt、G20、G30促RAW264.7 细胞的增殖活性
微图案组的细胞仍是沿着光栅阵列增殖，G20的活细胞（绿色荧光）数量较显著
，几乎没有死细胞（红色荧光），G30与Falt组相比，活细胞增殖情况差异不显著，但是死细胞数量略高。在细胞增殖活性检测中，三组材料在第1天的增殖活性检测中差异不显著，光栅组在第3、5天的OD值略高于Falt组，随着共培养时间的增加，各组OD值均上调，在第7天，光栅组的OD值上调更为显著。
相比于G30，巨噬细胞更易于粘附在G20尺寸的光栅凹槽，尺寸的增宽阻碍巨噬细胞通过调节肌动蛋白伪足向凹槽两侧的光栅条延伸。
图5 光栅微图案调控RAW264.7细胞极化性能
IL-10基因在第1天的表达中光栅组无明显优势，G30略低于Flat，在第3天时，G20组显著上调，高于Flat组，但G30组表达量下降，显著低于Flat组。第1天时，光栅组Arginase基因表达量显著高于Falt组，到了第3天，G30组明显下调。而TGF-β1的表达在两个时间点G20均最显著，Flat组次之。在促炎基因的表达中，第1天TNF-α的表达G20与Flat并无差异，但G30却显著上调。相比其他两组，iNOS和第3天的TNF-α表达G20表现为显著下调，而Flat组低于G30组。这表明，G20组能显著抑制促炎因子的释放，促进组织的修复重塑。通过流式细胞术定量分析光栅微图案结构巨噬细胞 M1型标记物CD11c占比。光栅组所检测的巨噬细胞 M1表型平均占比显著低于Flat组，而G30组显著高于G20组。在巨噬细胞M2型标记物CD206表达定量中，G20组的占比显著高于其余各组，而Flat组要高于G30组。综上所述，
G20组微图案对巨噬细胞 M2 极化和 M2 极化后其表型转化具有促进作用，同时还有效抑制 M1相关炎症因子的表达，降低细胞的炎症反应。
2、总结与展望
本研究结合软光刻和3D打印技术对PCL表面进行改性，成功制备出内部稳定可控的结构清晰的光栅阵列结构的三维支架
。在促进BMSCs成骨分化的同时为骨再生提供良好的免疫环境，具有良好的细胞兼容性，减轻炎症并加速骨组织再生，向骨填充材料的探索迈进了一步，为提供优质材料做出新的贡献。
参考资料：
https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2024.e26621
来源：EngineeringForLife
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