选择分析条件，这样做再好不过！

选择气相色谱分析的实验条件主要包括色谱柱的选择、柱温的选择和载气的选择。另外，还有一些其他条件的选择，包括气化室温度、检测室温度、进样量的选择等。

气相色谱分析中，应怎样选择实验条件?

选择气相色谱分析的实验条件主要包括：色谱柱的选择、柱温的选择和载气的选择。

(1)色谱柱的选择

主要是选择固定相和柱长。固定相选择需注意极性及最高使用温度。气一液色谱法还要注意载体的选择。高沸点样品用比表面小的载体、低固定液配比(1％-3％)，以防保留时间过长，峰扩张严重。低沸点样品宜用高固定液配比(5％-25％)，从而增大分配系数，以达到良好分离。难分离样品可用毛细管柱。柱长加长能增加塔板数，使分离度提高。但柱长过长，峰变宽，柱阻也增加，并不利于分离。在不改变塔板高度(H)的条件下，分离度与柱长有如下关系。

(2)柱温的选择

选择的基本原则是：

在使最难分离的组分有符合要求的分离度的前提下，尽可能采用较低柱温。低柱温可增大分配系数，增加选择性，减少固定液流失，延长柱寿命及降低检测本底。但柱温降低，液相传质阻抗增加，而使峰扩张，柱温太低则拖尾，故以不拖尾为度。可根据样品沸点来选择柱温。

分离高沸点样品(300-400℃)，柱温可比沸点低100-150℃。分离沸点<300℃的样品，柱温可以在比平均沸点低50℃：至平均沸点的温度范围内。对于宽沸程样品(混合物中高沸点组分与低沸点组分的沸点之差称为沸程)，选择一个恒柱温经常不能兼顾两头，需采取程序升温的方法。程序升温改善了复杂成分样品的分离效果，使各成分都能在较佳的温度下分离。程序升温还能缩短分析周期，改善峰形，提高环境监测中检测灵敏度。

(3)载气的选择

载气的选择从三方面考虑：

对峰扩张、柱压降及环境监测中检测器灵敏度的影响。载气采用低线速时，宜用氮气为载气，高线速时宜用氢气(黏度小)。色谱柱较长时，在柱内产生较大的压力降，此时采用黏度低的氢气较合适。H₂最佳线速度为10-12cm/s；N₂为7-10cm/s。通常载气流速可在20-80mL/min内，通过实验确定最佳流速，以获得高柱效，但为缩短分析时间，载气流速常高于最佳流速。

(4)其他条件的选择

①气化室温度

气化室温度取决于样品的挥发性、沸点及进样量。可等于样品的沸点或稍高于沸点，以保证迅速全气化。但一般不要超过沸点50℃以上，以防样品分解。对于稳定性差的样品可用高灵敏度检测器，降低进样量，这时样品可在远低于沸点温度下气化。

②检测室温度

为了使色谱柱的流出物不在检测器中冷凝而污染检测器，检测室温度需高于柱温。一般可高于柱温30-50℃左右，或等于气化室温度。但若检测室温度太高，热导检测器的灵敏度降低。

③进样量

进样量的大小直接影响谱带的初始宽度，进样量越大，谱带初始宽度越宽，经分离后的色谱峰宽也越宽，不利于分离。因此，在检测器灵敏度足够的前提下，尽量减少进样量。通常以塔片数减少10％作为最大允许进样量。柱超载时峰变宽，柱效降低，峰不正常。

※一般来说，柱越长，管径越粗，固定液配比越高，组分的分配系数越大，则最大允许进样量越大。对于填充柱，气体样品以0.1-1mL为宜，液体样品进样量应小于4μL或小于1μL。毛细管柱需用分流器分流进样，分流后的进样量为填充柱的1/100-1/10。

在液相色谱分析过程中，我们经常遇到的问题主要有二种，一种与液相色谱仪器本身因素有关，如,液相色谱的阀门、混合器、检测器的光源以及其它的一些硬件设备。出现这类问题后，如果能找出问题根源，解决起来一般很简单，而且这类问题可以通过对仪器的精心维护来避免；而另一类问题则是分析方法本身造成的问题，如，出现色谱峰形状不好、峰与峰之间不能分开、基线飘移等等。不幸的是，如果出现这类问题，看起来似乎很明显，但是要找出原因并解决这类问题却非常困难。为了减少出现这一类型的问题，就必须在分析之前，仔细研究并选择一个好的分析方法，有了一个好的分析方法，就很容易获得理想的分离效果，而且在出现问题是也很便于找出原因。要选择一个好的分析方法，就必须对液相色谱分析的一些基本原则要有一个很深的了解。下面是我们实验室对色谱分析人员进行技能培训的一些基本知识。

（1）分析方法选择的基本原则

假如你想做一顿丰盛的晚餐，首先必须看一下食谱，然后检查一下你所需的东西是否齐全，如果少了配料还必须去商店购买，这样你才可能做出一顿可口的晚餐。同样进行液相色谱分析时，也必须按照一定的程序进行，首先你必须要有专门的仪器和试剂，然后有目的地选择分析方法，这样你才可能得到好的分析结果，避免走一些弯路。

（2）柱子的选择

现在大部分液相色谱分析都是使用反相色谱柱，其中以C₁₈和C₈柱最为流行，然而，色谱分析并不是流行歌曲，这两种色谱柱之所以运用广泛是因为在大多数情况下，使用这两种柱子都能获得理想的分离效果。尽管一些样品的分离并不是这两种柱子(如，表一所示)，但C₁₈和C₈经常是最好的固定相，C₁₈和C₈柱两者之间并无明显的差别，但在我们实验室中以常使用的是C₈柱。色谱分析人员遇到的多数样品需要利用反相色谱柱进行分析，但一些样品可能需要其它的分析技术才能成功地分离，这些样品及分离方法在表一中作了简要的叙述，在以后的章节中将进一步阐述。

表一：样品及分析方法

在过去的15年中，高纯度、低金属杂质含量的硅胶基质色谱柱是最为实用的色谱柱之一。但传统色谱分析用的硅胶颗粒具有差异性及酸性表面，固定在柱子表面后，导致出现拖尾峰，而且柱与柱之间的重现性较差。最近硅胶基质中出现一种新的产品，这种硅胶具有Metal-free特性，因此，柱子性能更稳定，重现性也更好，分离后峰的形状也很不错。这种改性后的硅胶称为B型硅胶。由于具有上述优点，大多数色谱制造商都用不同的名称来表明它们与传统的产品之间的不同，如，Intertsil (日本)、 BDS(USA)、YMC--Base(USA)等等。大多数色谱柱制造商都生产以B型硅胶为基质的色谱柱，因此你可以选择你所喜欢的供应商提供的产品。由于这种产品具有上述特性，建议使用A型硅胶柱的改为使用B硅胶柱。

（3）柱子尺寸规格的选择

液相色谱分析时柱子选择的另一个因素就是柱子大小、及填充颗粒的直径(dp)的选择。最常用颗粒直径为5μm，但颗粒的直径(dp)为3.0及3.5μm的也适合分析使用，但大多数色谱工作者都喜欢使用颗粒直径为5μm的色谱柱，因为这种色谱柱具有很长的使用历吏。颗粒的dp小意味着可以获得较高的理论塔板数，但所需的柱压增大，而且dp为3.0μm的色谱柱易堵塞，所以一些色谱制造商又生产出dp为3.5μm的色谱柱。

在我们实验室中经常使用的是150mm×4.6mm，dp为5μm的色谱柱。另一种可以选择 的色谱柱为75mm×4.6mm，dp为3.5μm的柱子，这种柱子的分离效果与前一种色谱柱分离效果相似，但使用时间减小一半。这两种柱子还有一个优点就是在合理的压力下(<2000psi )，流速可以设定在1.5-2.0mL/min之间，而流速高意味着可以缩短分析时间。

有些分析者建议使用30 or 50mm长的柱子作为前处理柱，但这种柱子不能提供足够的塔板数。另一种意见是使用窄孔柱(2mmid)或微孔柱(≤1mmid)，这两种柱子所需的溶剂少，但是这两种柱子所需的某些仪器与正常使用的色谱仪有些不同，而且正处在一个研究阶段，建议等这两种色谱柱研究成熟之后再使用。

150mm×4.6mm，dp为5μm的色谱柱最为常用，75mm×4.6mm，dp为3.5μm的色谱柱也中较常见，在一般情况下流速可设定为1.5mL/min。

（4）有机相的选择

获得成功分离的另一个重要因素就是流动相有机溶剂的选择，如果使用反相色谱柱可以有三种有机溶剂可以选择，甲醇、乙腈和四氢呋喃。每一种溶剂都有其独特的优点，但色谱分析人员很少能预见哪一种溶剂更合适，所以具体选择哪一种溶剂你必须充分考虑同行的意见。

在我的实验室中多数工作分析药物中的成份，其中有些样品的紫外吸收很弱，所以，分析时紫外检测器的波长为220nm甚至更低，但是四氢呋喃的紫外吸收比较强，所以在波长低于240nm时，就不能选择这种溶剂。尽管低浓度的甲醇在较低的波长下也可使用，但是在低于220nm时，甲醇的浓度不易控制。选择何种溶剂还必须考虑其与样品及空气之间不发生作用，而四氢呋喃易分解，形成过氧化物，所以使用这种溶剂时须格外小心。一些研究人员发现，在四氢呋喃中加入水可以解决这个问题，但它与色谱柱平衡所需的时间比甲醇、乙腈长，而且其不愉快的气味也是一个不利因素。与四氢呋喃相比，甲醇和乙腈的最大优点是在柱压较低的条件下，流速可控制在1-2mL/min之间。

考虑到理想溶剂的特点，如粘度低、紫外吸收弱、与样品不相互作用，而且使用方便，所以首选的有机溶剂应是乙腈，当然利用甲醇作为有机溶剂的也较为常见。

（5）水相的选择

假如样品为一般化合物，可以用水作为水相，然而离子化合物在药物分析时普遍存在，而这类化合物需要控制pH值才能得到很好的分离。如流动相的pH值必须高于或低于样品的PKA1.5个单位。在分析有机酸时，当pH值低于3时，色谱柱一般还比较稳定，然而当PH值高于8时，就需要缓冲液，因为此pH值已经超出了二氧化硅的有效使用范围。宽PH值的二氧化硅柱也比较常见，但是对高pH值物质的分离，很少有这方面的报道。所以建议使用缓冲液来减少二氧化硅的流失。

考虑到样品的特性及柱子的稳定，建议在分析PH值较高的物质时应使用缓冲液，2.5mm的磷酸盐缓冲液 (pH=2.5)是非常合适的水相。如果在分析方法中使用了分光仪，那么就必须选择易挥发的缓冲液，尽管不如真正的缓冲液有用，但0.1%Trifluoroacetic酸和乙酸能够满足pH值的控制要求。

（6）其它因素

在你选择液相色谱的分析方法时，必须考虑到其它的一些因素，比如，温度。因为温度变化1度，保留时间将变化1-3%，所以温度控制十分重要，温度的变化还影响色谱柱的选择性，这会使你更积极地投入到温度选择中去。在分析时柱温一般比室温高一点(如，35℃)，因为此温易控制，而且在低压下有利于降低溶剂的粘度，从而降低柱压。有时你需要利用其它的一些方法 ，如在流动相中加入部分特殊的物质，不过我建议最好在你实在必须时才用这种方法，记住KISS原则(Keep it simple ，stupid)，不要使你的流动相过分复杂!

（7）总结

在液相色谱分析时条件的选择非常重要，而且流动相是你常年与之打交道的，所以你必须慎重选择。一些较为常见的分析条件如表二所示：

表二：分析条件内容

质谱仪种类很多，不同类型的质谱仪的主要差别在于离子源。离子源的不同决定了对被测样品的不同要求，同时所得到信息也不同。因此，在进行质谱分析前，要根据样品状况和分析要求选择合适的质谱仪。除了纯化合物的结构解析可使用直接进样分析外，药物分析目前均采用色谱一质谱联用技术，主要是：气相色谱一质谱联用仪和液相色谱一质谱联用仪，现就这两类仪器的分析条件叙述如下：

分析条件的选择

(1)GC-MS分析条件的选择

在GC-MS分析中，色谱的分离和质谱数据的采集是同时进行的。为了使每个组分都得到分离和鉴定，必须选择合适的色谱和质谱分析条件。

色谱条件包括：色谱柱类型，固定液种类，汽化温度，载气流量，分流比，温升程序等。质谱条件包括电离电压，电子电流，扫描速度，质量范围，溶剂去除时间等。这些都要根据样品情况进行设定。

(2)LC-MS分析条件的选择

LC分析条件的选择要考虑两个因素：

使分析样品得到最佳分离条件并得到最佳电离条件。如果二者发生矛盾，则要寻求折中条件。LC可选择的条件主要有流动相的组成和流速。在LC和MS联用的情况下，由于要考虑喷雾雾化和电离，因此，有些溶剂不适合于作流动相。不适合的溶剂和缓冲液包括无机酸、不挥发的盐(如：磷酸盐)和表面活性剂。不挥发性的盐会在离子源内析出结晶，而表面活性剂会抑制其它化合物电离。在LC-MS分析中常用的溶剂和缓冲液有水、甲醇、甲酸、乙酸、氢氧化铵和乙酸铵等。对于选定的溶剂体系，通过调整溶剂比例和流量以实现好的分离。值得注意的是对于LC分离的最佳流量，往往超过电喷雾允许的最佳流量，此时需要采取柱后分流，以达到好的雾化效果。

质谱条件的选择主要是为了改善雾化和电离状况，提高灵敏度。调节雾化气流量和干燥气流量可以达到最佳雾化条件，改变喷嘴电压和透镜电压等可以得到最佳灵敏度。对于多级质谱仪，还要调节碰撞气流量和碰撞电压及多级质谱的扫描条件。

在进行LC-MS分析时，样品可以利用旋转六通阀通过LC进样，也可以利用注射泵直接进样，样品在电喷雾源或大气压化学电离源中被电离，经质谱扫描，由计算机可以采集到总离子色谱和质谱。

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