FRMD6通过Hippo-YAP-CCN3轴调控细胞衰老

细胞衰老是一种以细胞周期阻滞以及衰老分泌相关表型（ SASP ）增加等为标志的特殊细胞状态，被认为是衰老相关疾病例如肺纤维化等产生的原因之一。因此，靶向细胞衰老的治疗策略成为了目前的研究热点，但细胞衰老产生的具体原因目前还未被完全揭示。 Hippo 信号通路在多种生物过程中发挥重要作用，已明确其下游的YAP/TAZ活性降低可加速机体衰老。然而目前对于 Hippo 通路上游的相关调控仍然知之甚少，阻碍了相关治疗的研发。

基于此，来自韩国忠北大学的 Eung-Gook Kim 教授以及 Eun-Young Shin 教授团队 利用多组学分析，探究并明确了 4.1 ezrin-radixin-moesin (FERM) 结构域蛋白 6 （ FRMD6 ）可通过 Hippo-YAP-CCN3 轴调控细胞衰老的命运，为衰老相关疾病的治疗寻找了潜在的治疗靶点。

研究者前期研究发现，沉默β -p21 活化激酶相互作用交换因子 ( β PIX ) ，可引发细胞衰老。在本研究中，研究者进一步通过双向质谱标记（ TMT ）蛋白质组学分析，发现β PIX 蛋白缺失后，细胞中出现了 4643 种差异表达的蛋白质，通路分析表明与复制性衰老相关的通路上调，而核小体组装和 DNA 修复相关的通路则显著下调（图 1a ， b ）。火山图和 WB 的结果进一步证实了 FRMD6 以及其它与衰老相关的蛋白例如 p16 、 p21 、纤溶酶原激活物抑制剂 -1 (PAI-1) 、生长分化因子 15 (GDF15) 和胰岛素生长因子结合蛋白 3 (IGFBP3) 等蛋白的变化（图 1c ， d ）。由于 FRMD6 已被报导在衰老相关的 Hippo/YAP 信号传导具有潜在作用，研究者后续重点探究了 FRMD6 对细胞衰老的具体作用及其生物学机制。研究者通过阿霉素（ DOX ）诱导了细胞衰老，发现细胞中 FRMD6 显著上调（图 1e-h ），而敲降 FRMD6 后可以显著降低衰老细胞的比例 ( 图 S3a-c) ，提示 FRMD6 与细胞衰老密切相关。

研究者进一步探究了过表达 FRMD6 对 IMR90 成纤维细胞衰老的影响。结果显示，过表达 FRMD6 引起成纤维细胞中衰老标记物 p21 、 p16 以及 pp53 表达的显著上调（图 2a ）。与此同时，细胞的增殖能力下降、 SA- β -Gal 活性升高、 SASP 分泌增加（图 2b ， c ）。表明 FRMD6 的过表达成功诱导 IMR90 纤维细胞出现典型的细胞衰老表型。此外，在支气管上皮细胞中， FRMD6 的过表达同样导致细胞衰老（图 2e-h ），进一步证实了 FRMD6 在诱导细胞衰老中的作用。

由于 FRMD6 位于 Hippo 信号通路上游，因此，研究者就 FRMD6 过表达对 IMR90 细胞中的 Hippo/YAP 信号通路的影响进行了检测。结果显示，在 FRMD6 上调诱导的衰老细胞中， YAP/TAZ 的磷酸化水平显著升高，并且 YAP 几乎不在核内表达（图 3a-c ），表明 Hippo/YAP 信号通路 可能参与 FRMD6 诱导的细胞衰老。为证实 Hippo/YAP 信号通路的重要性，研究者在 FRMD6 诱导的细胞衰老模型中过表达活性的 YAP （ S127A ），发现其可显著抑制 FRMD6 过表达所引起的细胞衰老（图 3d-f ），说明 Hippo/YAP 轴在 FRMD6 诱导的细胞衰老中发挥重要作用。

作为 SASP 重要的分泌因子，细胞通信网络因子（ CCN3 ）的 mRNA 和蛋白水平在 FRMD6 诱导的衰老细胞中均显著下调（图 4a-c ）。因此研究者猜想， CCN3 可能是 FRMD6-Hippo/YAP 信号通路的下游标靶。研究者通过相关实验发现， CCN3 在 YAP 过表达的条件下表达升高（图 4e ），并且外源性 CCN3 可显著抑制 FRMD6 诱导的细胞衰老（图 4f-h ），表明 CCN3 作为 YAP 下游靶基因在抑制 FRMD6 诱导的衰老中发挥关键作用。

尽管 FRMD6 已被证实可 调控 Hippo 信号通路 ，但其中的分子机制并不明确，因此研究者对此展开了研究。发现 FRMD6 提高了丝氨酸苏氨酸激酶（ MST ）及其下游 MOB 以及 YAP 的磷酸化水平，通过 XMU-MP-1 抑制 MST 的磷酸化则可拮抗 FRMD6 对 MOB 以及 YAP 磷酸化水平的影响（图 5a ），表明 MST 位于 FRMD6 下游参与对 YAP 的调控。免疫共沉淀显示， FRMD6 与 MST 直接结合（图 5b ， c ），在 DOX 诱导的衰老细胞中， FRMD6-MST1 的相互作用进一步增强（图 5d ）。此外，在 DOX 诱导的衰老模型以及自然衰老细胞中， FRMD6 水平均显著升高但可以被磷酸酶 PP2A 所抑制，证明 FRMD6 升高的部分主要为磷酸化的 FRMD6 。抑制 MST 的磷酸化后， FRMD6 的磷酸化水平也显著降低，且 FRMD6 和 MST1 之间的作用被削弱。该结果表明，衰老细胞中 FRMD6 的上调通过增强与 MST 之前的相互作用，激活 MST 的磷酸化，磷酸化的 MST 进一步引起 FRMD6 的磷酸化，形成正反馈循环，最终导致 YAP 的失活 ( 图 5h) 。

虽然衰老细胞表现出 FRMD6 水平的升高，但其发生机制并不清楚。研究者通过分析三种诱导衰老条件下转录因子激活的情况，发现五种常见的转录因子（ p53 、 SMAD 、 Oct1 、 TCF/Lef 和 ROR ）均显著升高（图 6a ）。研究者重点关注 p53 以及 SMAD 在其中的作用，发现沉默 p53 以及 SMAD2 后，细胞的衰老水平以及 FRMD6 表达水平均显著下调（图 6b-d ），说明 p53 与 SMAD 参与了细胞衰老的进程。

考虑到 TGF- β已被报导具有广泛的诱导衰老作用，研究者进一步探究了 TGF- β对于 FRMD6 的影响。结果显示， FRMD6 的表达随着 TGF- β处理浓度以及时间的增加显著上调（图 6e ， f ）。而使用 A-8301 抑制细胞 TGF- β 1 受体，或抑制细胞中 p53 、 SMAD2 的表达，均可显著抑制 IMR90 细胞的衰老以及 FRMD6 的表达升高（图 6g-i ），而过表达 FRMD6 则会引起细胞中 TGF- β的表达和分泌增加（图 6j ， k ）。表明 TGF- β可上调 FRMD6 表达，促进细胞衰老，并作为 SASP 因子进一步刺激 TGF- β的分泌引起恶性循环，加速衰老（图 6i ）。

据报导，在体内 TGF- β可诱导细胞衰老和肌成纤维细胞的分化，但这些过程通常不会同时发生。因此，研究者继续就 FRMD6 在细胞命运决定中的具体作用进行了探究。发现敲降 FRMD6 后可显著减少衰老细胞的比例以及细胞中衰老标记物 p21 、 p16 的表达（图 7a ， b ），但对α -SMA 的表达没有显著影响。免疫荧光结果显示， TGF- β可以诱导细胞中 FRMD6 、 p21 以及α -SMA 表达的升高，而敲降 FRMD6 仅能降低 p21 的表达，对于α -SMA 没有显著的影响（图 7d-f ），表明 FRMD6 特异性参与衰老通路，对于肌成纤维细胞的分化没有影响。这与临床肺纤维化患者肺部的情况非常类似，在肺纤维化患者的纤维化区域通常含有大量高表达 α-SMA 的肌成纤维细胞与大量的细胞外基质，而其中原有的衬里细胞则表现出明显的细胞衰老表型（图 7g ）。免疫荧光染色结果也相似， PRMD6 只与 p16 的共定位，表明 FRMD6 主要影响了肺纤维化过程中细胞的衰老。

综上所述，研究者发现 FRMD6 通过 Hippo-YAP-CCN3 轴在细胞衰老的进程中发挥关键作用。靶向 FRMD6 及其信号通路可能为衰老相关性疾病的治疗与干预提供新的方法。

该研究由韩国忠北大学 Eung-Gook Kim 教授以及 Eun-Young Shin 教授团队完成，并于 2024 年 6 月 24 日在线发表于 Cell Death & Differentiation 。

文献信息： Jung-Jin Park, Su Jin Lee, Minwoo Baek, Ok-Jun Lee, Seungyoon Nam, Jaehong Kim, Jin Young Kim, Eun-Young Shin* and Eung-Gook Kim*. FRMD6 determines the cell fate towards senescence: involvement of the Hippo-YAP-CCN3 axis. Cell Death & Differentiation 2024, doi.org/10.1038/s41418-024-01333-2.

供稿：于启帆

审校：过倩萍

编辑：许梦平