mLife｜上海交通大学杨广宇等：AI破解酶稳定性定向进化中的多个突变位点高效重组问题

优化酶的热稳定性对于蛋白质科学和工业应用至关重要。目前，通过（半）理性设计和随机诱变方法可以较为准确地设计多个增强酶热稳定性的单点突变。但当组合多个突变时，常常会出现复杂的上位效应，导致组合突变体完全失活。因此，优化酶通常需要进行多轮设计，从而逐步引入单个突变位点，整个过程非常耗时。

2024年12月26日，上海交通大学生命科学技术学院杨广宇研究员团队的文章“Optimizing enzyme thermostability by combining multiple mutations using protein language model”在mLife正式上线，上海交通大学自然科学研究院洪亮教授为共通讯。

其中，最佳突变体13M4包含13个突变位点，与野生型相比，它的活性基本保持不变，在 T _m 上提高了10.19°C，在58°C下的半衰期增加了约655倍。

在回顾数据时发现，即使某些突变在空间上相距甚远，也存在复杂的高阶上位性效应。例如K351E单点突变表现为阴性突变，但其在高阶突变体中却表现为阳性突变。此外，单点突变D17V和I149V存在明显的协同作用。结果表明，使用高质量的实验数据微调模型的参数，可以帮助模型准确捕获数据集中的已存在的上位效应，并用于后续高阶组合突变体的适应度预测。

动态相关矩阵分析的结果表明，影响稳定性的突变不仅影响其局部环境的动力学，在某些情况下，还影响远端结构区域的动力学（图3）。该项技术可以作为未来研究或设计上位效应的一个有效工具。

图3  突变之间的上位效应分析。K351E (A) 和 D17V/I149V (B) 在T _m 值上的上位效应。蓝色表示负效应，橙色表示正效应。(C) 肌酸酶野生型和对应突变体的动态互相关矩阵图。相关系数 (Cij) 用不同颜色表示。突变位点用红色箭头标出，突变周围显著的动力学相关区域用红色框突出显示。(D) 突变体结构与野生型结构比较的的标准化 RMSF变化

1. 本研究提出的人工智能辅助的酶热稳定性工程策略，可以高效地组合多个有益单点突变。 仅通过两轮设计，共表征50个组合突变体，稳定性设计成功率达到100%。与野生型相比，最佳突变体13M4的 T _m 提升了10.19℃，58℃半衰期增加655倍，同时催化活性保持不变。

2. 通过利用少量但高质量的实验数据微调蛋白质语言模型参数，微调后的模型可以准确捕捉初始数据集中的上位效应 ，包括符号和协同上位效应。这表面，实验数据对于提升模型对高阶组合突变体的预测性能至关重要。

3. 利用动态相关矩阵分析，该研究揭示了长程上位效应的机制 ，显示了远距离突变之间在动力学上的相关性，从而共同影响突变体的稳定性。

4. 通过采用这种策略，研究团队仅通过两轮设计，全面探索了组合序列空间中超26万种可能的突变体，最佳突变体包含13个突变， 大大缩短了传统方法中所需要的进化轮次，提升了蛋白质工程的效率 。

5. 研究强调了将来自蛋白质工程的数据与先进的人工智能模型相结合，可以进一步提升模型的预测性能，从而提升蛋白质工程效率 。该策略可以推广应用至多种关键酶分子的进化任务中。