Plus深读 | 单细胞分析能预测抗PD-1的免疫治疗效果

翻译/mackaay

免疫检查点抑制剂已经彻底改变了癌症治疗。特别是，科学家发现抑制程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）能有效治疗转移性黑素瘤和其他肿瘤。尽管无进展生存期显著增加，但大部分患者并未表现出持久的反应。因此，有必要寻找一种能预测治疗临床反应的标志物。在进行临床应用PD-1之前，通过某个指标就能了解该患者是否能对免疫治疗有反应。这样，就能精准地对有效患者进行治疗。通过查验患者血液中某些T细胞亚群的分布情况是否可以判断出该患者是否对抗PD-1有很好的治疗反应？这是目前肿瘤免疫治疗的一个热点问题。在这研究中，作者使用高维单细胞质量流式细胞术，对抗-PD-1免疫治疗12周前后IV期黑素瘤患者外周血中免疫细胞亚群进行深入研究。

对抗PD-1治疗效果分层

作者首先从20名患有黑素瘤的患者血液中分离的40个外周血单核细胞（PBMC）样品进行初始分析。抗PD1治疗12周后获得的基线样品和治疗后样品来源于相同的患者。

数据预处理后，作者对每个患者在治疗开始之前和之后表达白细胞共同抗原（CD45）的活细胞进行分层聚类（图1a）。结果显示两个主要的样本分支——一个包含15个样本，其中全部是响应者，另一个（右分支）由25个样本组成，其中18个（72％）是无响应者（图1a）。这种无监督聚类方法能在治疗前将患者分为应答者和无应答者。

图1：对无应答和有应答患者分层，并对免疫细胞群鉴别其差别

作者通过研究全部29个白细胞标志物的中值表达量（图1b），开始在治疗开始前后的应答者和无应答者之间进行比较分析。治疗前在应答者中观察到HLA-DR，CTLA-4，CD56和CD45RO有较高表达以及较低量的CD3，CD27和CD28。

接下来，作者试图确定哪些细胞群在细胞频率方面可以最好地描述了响应者和无响应者之间的差异。使用主成分分析（PCA）信息量分数选择用于随后细胞群集的标志物。tSNE投影用于可视化，以及每个聚类中标准化（0-1）中值标记表达的热图（图1c）。作者随后检查了三组（健康供体（HD），无应答者（NR）和应答者（R））之间鉴定聚类的频率差异（图1d）。值得注意的是，条形码允许模型追踪患者并匹配基线和治疗样本进行分析。在应答者中，CD4 + T细胞和CD8 + T细胞的频率较低，而CD19-HLA-DR +骨髓细胞的频率显着较高分别高于无反应者（治疗开始前后）（图1d，e）。

由于T细胞是抗PD-1免疫治疗的主要靶点，并且在免疫治疗前给予反应者中T细胞组成的改变，作者接下来比较了在治疗开始之前和之后的无应答者和应答者之间，CD4 +和CD8 + T细胞中的中值标记表达（图1c，d）。在应答者中CD4 + T细胞合并治疗前后活化标记CTLA-4，HLA-DR，CD69和BTLA有显著上调（图2a）。类似地，应答者中的CD8 + T细胞显示CD45RO，CTLA-4，CD62L，CD69，CD11a和CCR4有更高表达（图2b）。

图2：在PD-1治疗12周后，无响应和有响应的患者中T细胞亚群激活差异和分布频率

为了进一步确定T细胞亚群是否存在差异，作者对提取的CD4 + T细胞和CD8 + T细胞重新进行分析，并将这些群细分为CD45RO-CD62L +幼稚细胞，CD45RO-CD62L-效应物（TE）细胞，CD45RO + CD62L-效应记忆（EM）细胞，CD45RO + CD62L +中央记忆（CM）细胞或CD127-CD25 +调节性T细胞（Treg）。然后，作者比较治疗开始前和治疗后12周内应答者和无应答者之间产生的T细胞亚群的频率（图2c，d）。最终对治疗有反应的患者在基线和治疗开始后显示循环CD4 + EM T细胞频率显着较低以及CD8 +幼稚T细胞频率较低。另外，应答者的CD8 + T细胞亚群在治疗开始之前和之后具有比不应答者的CD8 + T细胞亚群更高的CM T细胞频率。作者还发现肿瘤患者的Treg细胞与健康对照相比显著增加（图2c）。

抗PD-1治疗能改变T细胞特征

为了比较无应答者和应答者之间T细胞的功能特性，作者研究了多克隆活化细胞中产生的细胞因子。作者提取了表达细胞因子（IL-2，IL-4，IL-10，IL-13，IL-17A，GM-CSF，TNF-α，IFN-γ和粒酶的（Grz）-B），PD-1或CTLA-4的T细胞频率（图3和4）。在治疗开始后，响应者中表达PD-1，IL-4，IFN-γ，IL-10，IL-17A和Grz-B的CD4 + T细胞数量高于无应答者（图3a- d）。对于CD8 + T细胞，响应者中检测到CTLA-4和粒酶B的上调（与无应答者相比）（图4a-d）。在图3c和4c中分别显示CD4 + T细胞或CD8 + T细胞中发现响应者和无响应者之间富集差异的细胞因子组合组（CCG）。使用这种方法，作者在CD4 + T细胞亚群中发现了三个CCG，这些CCG在反应者中比在无反应者中观察到更高的频率（图3c）。对于CD8 + T细胞，与无应答者相比，应答者发现13个CCG增加，一个CCG减少（图4c）。在CD4 + T细胞中扩大的CCG中，最常见的标记是CTLA-4 +，粒酶B +，TNF-α+和PD-1 +；因此，这些CCG的表型类似于CM T细胞的表型（图3d）。至于CD8 + T细胞，CCG 1是唯一一个比较无反应者响应时频率下调的细胞，没有表达细胞因子，其细胞表面表型与TE细胞类似（图4d）。唯一与TE细胞相似的其他细胞群是CCG14，其是粒酶B +，TNF-α+，IFN-γ+和IL-2 +。其余12个增加的CCG对至少两种标志物和细胞因子组合是阳性的（图4d）。

图3：在免疫应答的患者中CD4+ T细胞活化增加

图4：在免疫应答的患者中CD8+ T细胞活化增加

髓系细胞能反映抗PD-1治疗效果

作者发现抗PD-1治疗反应者中治疗前的骨髓细胞频率较高（图1d），所以作者研究了髓系细胞的情况。使用FlowSOM分析分离出7个亚群，其被注释为T细胞，B细胞，NK细胞，CD14 +（CD11b + HLA-DRhi）骨髓细胞，CD14-（CD11b + HLA-DR10）骨髓细胞，经典CD1c + CD11c + HLADR +树突细胞（cDC）和浆细胞样树突细胞（CD123 + CD303 + HLA-DR + CD11c-; pDC）。如图1d所示，应答者中观察到T细胞频率显着较低，CD14 +髓样细胞频率高于无应答者。虽然作者发现肿瘤患者的CD14髓样细胞数量确实高于健康供者，但作者没有观察到应答者和无应答者之间的这种细胞群体的差异。接下来，为了更好地探究骨髓细胞，作者通过圈出T细胞（CD3 +）和B细胞（CD19 +）细胞并排除NK细胞（CD7 +和CD56 +）从进一步分析中提取活髓细胞。在骨髓细胞中的非监督聚类再次将患者分成两个不同的簇，一个分支主要由无应答者组成（12/14; 86％），另一个分支主要由应答者组成（19/25; 76％ ）（图5b）。

作者接下来搜索了治疗开始前和治疗后12周无应答者和应答者之间的中位标记表达变化。作者发现与无应答者相比，应答者的骨髓区16个标记显着升高（图5c）。接下来，使用FlowSOM分析将骨髓细分成四个主要簇，其被注释为经典单核细胞（CD14 + CD16-HLA-DRhi），CD14-骨髓细胞，pDC和cDC（图6a）。

图5：根据髓细胞标志物对患者进行分层

RNA测序显示髓系细胞特征

为了确定单核细胞标记中是否存在细胞内在变化，作者对来自健康供体，无应答者和应答者的CD14 + CD16-HLA-DRhi细胞进行RNA测序（RNA-seq）分析。在癌症患者与健康供体之间观察到最显着的基因表达差异。差异表达的基因富含在癌症患者的代谢，迁移和炎症有关的通路上（图6b）。这些数据表明治疗前，循环髓样细胞的频率而非基因表达模式或单核细胞极化与抗PD1免疫疗法的响应性相关。

在应答者治疗前，有数据证实T细胞频率较低，CD14 +单核细胞频率较高（图6c）。为了评估经典单核细胞在治疗前获得的生存获益，作者计算了单核细胞频率的最佳临界点，并在该最佳临界点对反应者和无反应者进行了最佳分层（图6d）。由此产生的图显示，基线时高频率或低频率的典型单核细胞患者之间的风险比存在明显差异。因此，作者的模型表明，在抗PD1治疗开始之前，经典单核细胞频率> 19.38％预示着更好的治疗反应和患者存活（图6d）。

图6：有应答者中经典单核细胞激活

小结

旨在寻找免疫疗法反应的生物标志物大多数研究都集中在肿瘤活检上。早期研究使用免疫组织化学方法来评估肿瘤细胞和/或肿瘤微环境中免疫细胞上的PD-L1表达，作为抗PD-1和抗-PD-L1治疗的预测性生物标志物。尽管对于肿瘤样本表达PD-L1的患者与不具有PD-L1表达的患者报道了更高的应答率，但发现一些肿瘤样本缺乏PD-L1表达的患者对ICT也有反应。因此，PD-L1表达被认为是预后生物标志物而不是预测性生物标志物。最近的研究也集中在遗传生物标志物上，而不是免疫生物标志物。一些癌细胞固有的基因组不稳定性导致这些细胞中的基因突变数量增加，并产生突变的蛋白质，作为免疫系统的潜在抗原，使得这些癌症适合用ICT治疗。作为这些研究的结果，FDA根据基因组不稳定性的遗传生物标志物而不是肿瘤类型8对ICT患者的选择和治疗给予了首次批准。但是，外周血中的生物标志物也还在探索中，因为它提供了更容易采集样本的可能性。

当然，需要进一步的研究来了解单核细胞在抗肿瘤免疫中的机制作用。此外，CyTOF是一个强大的工具，在未来的生物标志物研究中具有巨大的潜力；但是，它目前仍然处于探索阶段。