JACS｜合成凝聚体平台助力分子胶精准筛选与调控

蛋白质相互作用 （Protein-protein interactions, PPIs） 是生命活动的核心，其异常调控常导致癌症、神经退行性疾病等。“分子胶”因其能稳定PPIs而成为药物开发的热点，但传统生化方法难以有效筛选这类分子，因为细胞内许多PPIs是短暂且弱结合的，依赖局部高浓度环境 （如生物分子凝聚体） 发挥作用，而传统体外实验在稀释溶液中无法复现这种条件。近日，荷兰埃因霍温理工大学的研究团队开发了一种基于合成凝聚体的平台，通过模拟细胞内的密集分子环境，显著增强了弱PPIs的检测能力，并系统验证了分子胶的稳定作用。这一平台为潜在分子胶药物的发现提供了全新工具。

研究团队设计了一种由季铵化淀粉 （Q-Am） 和羧甲基化淀粉 （Cm-Am） 组成的合成凝聚体（图1）。这些带相反电荷的多糖通过相分离形成密集的液滴，内部局部蛋白浓度可比溶液环境高数十倍。此外，凝聚体表面包裹了一层半透膜聚合物，防止液滴间的融合并维持稳定性。由于蛋白14-3-3是一个参与许多重要信号通路PPI的枢纽蛋白，因此作者通过Ni2+-NTA-Am将带His标签的枢纽蛋白14-3-3固定在凝聚体中，验证分子胶Fusicoccin A （FC） 对14-3-3蛋白及其多个客户蛋白的稳定作用。

图1. 体外合成凝聚体的组成与稳定PPI的小分子筛选方法示意

作为底物的客户肽 （如CIP2A、SSBP4） 的招募通过荧光标记和共聚焦显微镜定量（图2）。结果显示，分子胶Fusicoccin A（FC）能显著增强客户肽的招募（图2a-f），而对照肽c-Raf pS259 （不受FC调控） 则无响应（图2g-h）。这表明平台能特异性捕捉分子胶介导的PPI稳定效应，并且是剂量依赖的（图2i-j）。当FC浓度从1 μM增加到100 μM时，底物CIP2A的招募逐步增强。

图2. 分子胶FC促进14-3-3对底物的招募

研究团队还测试了FC的半合成类似物（图3a），它们对14-3-3的亲和力不同，对底物的招募具有不同效果。在1 μM浓度下，仅FC和FC-NAc能显著增强CIP2A招募（图3c-d），与荧光偏振 （FA） 实验的结果一致（图3b）。但当浓度升至100 μM时，FC-THF和FC-31也表现出活性。这种差异可能源于凝聚体环境对分子胶结合动力学的微调。

此外，竞争性结合实验揭示了环境对PPI的调控（图3e-f）。HSPB6 （一种中性电荷肽） 与带负电的CIP2A竞争结合14-3-3时，CIP2A在凝聚体中占据优势，尽管其在溶液中的亲和力较低。这说明凝聚体的电荷环境可模拟细胞内的选择性招募机制。

图3. 对招募底物效果表现不同的分子胶

为适应药物高通量筛选需求，团队开发了分光素酶互补法（图4）。将NanoLuc荧光素酶的大亚基 （LgBiT） 和小亚基 （SmBiT） 分别融合到ERRγ和14-3-3γ上，两者通过PPI稳定后发光。实验显示，能结合ERRγ和14-3-3γ的分子胶 （如R1-R3） 能显著增强发光信号（图4d），而只能结合一个组分的分子胶 （R4） 或在溶液中无法稳定PPI的对照分子胶 （R5） 则无效。

图4. 在合成凝聚体中利用荧光素酶互补法筛选分子胶

合成凝聚体的优势之一是可调节的微环境。通过改变pH或添加还原剂TCEP，团队验证了动态共价分子胶的活性依赖环境条件（图5）。例如，在pH 8.0时，醛基分子胶R1的活性最高（图5b），而高浓度TCEP会抑制二硫键形成（图5e）。这种可控性为模拟特定细胞区室 （如溶酶体或线粒体） 提供了可能。

图5. 通过改变合成凝聚体中的环境来进行特异性筛选

为证明平台的普适性，团队研究了核受体PPARγ与其共调节因子的相互作用（图6）。PPARγ的功能发挥依赖于配体结合引发的构象变化——当药物分子进入PPARγ的配体结合口袋后，蛋白质结构发生重排，暴露出共调节因子 （如PRIPRAP） 的结合界面（图6a）。例如，Tesaglitazar （K_D=0.03 μM） 在10 μM浓度下即可显著增强PRIPRAP的招募，而亲和力较弱的Rosiglitazone （K_D=0.29 μM） 效果减弱（图6d-e），且招募水平与配体亲和力正相关（图6f）。在合成凝聚体的环境中，共调节因子的招募强度与配体亲和力呈正相关。实验进一步揭示了剂量依赖性的精细调控。当Tesaglitazar浓度从1 μM增至100 μM时，PRIPRAP的招募强度呈现渐进式提升（图6g），这与临床中药物剂量-效应关系高度吻合。

图6. 核受体PPARγ和其共调节因子的PPI能通过合成凝聚体进行调节

此外，拮抗剂GW9662可阻断激动剂效应（图7），表明平台能模拟复杂的药物竞争场景。拮抗剂GW9662通过共价结合PPARγ配体口袋中的Cys285阻断Tesaglitazar的激动效应（图7a）。在共聚焦显微成像中，单独使用GW9662时，PRIPRAP的招募水平与空白对照组无异；而当GW9662与Tesaglitazar共同加入时，激动剂的效应被彻底抑制（图7b-c）。这一结果表明凝聚体环境能够维持蛋白质的动态可逆性——即使在高浓度药物存在下，PPARγ仍能响应竞争性分子的调控，这与细胞内信号通路的实时调节特性高度一致。

图7. 拮抗剂GW9662阻断了配体对于PPARγ招募共调节因子的影响

该研究开发了一种合成凝聚体平台，用于研究分子胶在高浓度分子环境下对 PPI （蛋白质-蛋白质相互作用） 的稳定作用。这个平台的优势在于有环境可控性，能通过调节电荷、pH、氧化还原状态模拟特定细胞环境；有高通量兼容性，分光素酶法适用于大规模筛选；有广泛适用性：从14-3-3到核受体蛋白PPARγ，平台可拓展至多种PPI类型。

未来，团队计划用蛋白质或核酸替代淀粉衍生物，以更精准地模拟天然凝聚体的非共价相互作用。这一平台有望填补传统生化实验与细胞研究之间的鸿沟，加速分子胶药物的开发。

供稿 | 吴其乐

责编 | 囡囡

设计 / 排版 | 可洲