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【文献速递】BCMA CAR-T细胞治疗后CD4+ CAR-T细胞耗竭与MM的早期复发相关

大叔快评  · 公众号  ·  · 2024-10-08 18:55

正文



关键信息

通过对患者血液和骨髓进行单细胞检测发现,CD4 + CAR-T细胞耗竭与早期复发有关。

骨髓瘤微环境中的髓系细胞通过TGF-β钝化CD4 + CAR-T细胞的杀伤力。


摘要

多发性骨髓瘤(MM)在常规治疗后易出现临床复发。近期,靶向B细胞成熟抗原(BCMA)的嵌合抗原受体(CAR)T细胞已被确定为复发或难治性MM患者的一种治疗选择。然而,尽管70%以上的患者最初对这种治疗方法有反应,但大多数都会出现临床复发和疾病进展。

最近的研究显示,BCMA在复发时持续表达,表明免疫内在机制可能是导致这种耐药性的原因。尽管之前并无与临床结局相关的T细胞特征,但研究人员发现,CAR-T细胞治疗后达到持久缓解的患者,其CAR-T细胞的持久性超过一过性临床缓解的患者。CD8 + T效应记忆细胞的比例也显著增高。相比之下,治疗反应短暂的患者细胞毒性 CD4 + CAR-T 细胞的频率更高。这些细胞在输注后早期在体内扩增,但表达衰竭标记(甲型肝炎病毒细胞受体 2 [HAVCR2] 和含T细胞免疫球蛋白和粘蛋白结构域-3 [TIGIT]),并保持多克隆性。

最后,研究证明非典型单核细胞在骨髓瘤微环境中富集,并可能通过包括转化生长因子β在内的机制诱导 CAR-T 细胞功能障碍。这些发现揭示了细胞毒性 CD4 + T 细胞在CAR-T细胞治疗后疾病进展中的作用。


前言


多发性骨髓瘤(MM)是一种浆细胞肿瘤,在发达国家中占血液系统恶性肿瘤的10%。尽管在过去十年中取得了长足的发展,但它在很大程度上仍然无法治愈,复发被认为是病程中不可避免的一部分。B细胞成熟抗原(BCMA)已成为复发/难治性(R/R)MM的一个有前景的治疗靶点。成熟B淋巴细胞和浆细胞优先表达BCMA。由于其特异性,BCMA已成为嵌合抗原受体(CAR)T细胞的潜在靶点。这些经过基因修饰的T细胞表达与共刺激和信号域连接的抗BCMA单链可变片段,并且与细胞表面BCMA结合后,激活和效应功能导致骨髓瘤细胞溶解。

尽管抗BCMA CAR-T细胞治疗R/R MM在缓解率方面取得了可喜的成果,但缺乏持久缓解的现象却很常见。造成这种现象的可能原因包括CAR-T细胞的内在特性,如扩增能力和T细胞衰竭/功能障碍细胞状态,以及CAR-T细胞的外在因素,如抗原逃避和敌对骨髓(BM)微环境的免疫抑制。然而,既往研究表明,免疫微环境可能决定对双特异性T细胞接合器抗体的应答,而不是对CAR-T细胞的应答。

为深入了解R/R MM和功能性高危MM患者对抗BCMA CAR-T细胞的长期应答所涉及的因素,研究对接受过抗BCMA CAR-T细胞治疗的15例患者(78个样本;平均每个患者5个样本)和5例年龄匹配的对照组参与者的690 939个T细胞进行了单细胞测序,同时进行了T细胞受体(TCR)克隆性评估,另外还对骨髓瘤龛中的227 420个非B非T免疫细胞进行了纵向分析。研究人员开发了一种计算方法,可通过靶向测序来识别抗BCMA CAR-T细胞,结果表明,在早期复发患者中,体内CD4 + CAR-T细胞表达细胞毒性和衰竭标志物,并具有多克隆TCR特征。


研究结果


骨髓瘤BM微环境富含GZMB CD8 + 效应T细胞

为了解骨髓瘤患者的 T 细胞状态,研究人员在基线(淋巴细胞清除前)和输注后纵向收集了 BM 和 PB 样本(15 例患者的 78 份样本;中位额外3个时间点)。此外,还在手术室收集了 5 例因孤立性骨关节炎而接受髋关节置换手术的患者的 T 细胞。对 CD45 + CD19 - CD3 + 淋巴细胞进行了新鲜分选(样本采集后 4 小时内。新鲜分选的细胞在 10x Genomics 微流体平台上进行单细胞基因表达,并结合 TCR 和寡标记表面标记抗体(CITEseq)。

去除双重细胞并过滤后,690 939 个T细胞成簇。根据经典标志物进行了细胞状态注释,发现了 14 种不同的 T 细胞状态(图 1A)。不同细胞状态的代表性基因包括颗粒酶(细胞毒性)、 CCR7 (幼稚)、 FOXP3 (调节性T细胞)以及 MKI67 TOP2A (增殖或周期;图1B)。为了将 MM 患者与接受髋关节置换术的参试者进行比较,生成了密度降维图(图1C),并比较了每个簇内各组的细胞比例(图1D)。MM患者富集于GZMB CD8 + T效应细胞簇,而接受髋关节置换术的参与者富集于CD4幼稚细胞簇。所选基因的热图显示,MM 患者的 T 细胞优先表达耗竭标志物( CD70 CD38 HAVCR2 LAG3 IL2RA )(图 1E)。


图1 骨髓瘤和年龄匹配的健康对照组的T细胞状态

(A) 690 939 个细胞状态注释的T细胞的UMAP;(B) 每种细胞状态下选定代表基因的标准化表达的Violin图。(C)健康对照组(HCs)和MM患者的T细胞密度图。(D)柱状图显示HC和MM中每种细胞状态的比例。显著性水平通过Wilcoxon秩和检验确定(P<0.001)。(E)HC和MM中部分差异表达基因的标准化表达热图。

IFN,干扰素;MAIT,粘膜相关恒定T细胞;NKT,自然杀伤T细胞;Tcm,中央记忆T细胞。


CAR-T 细胞注释、细胞状态和克隆性

为了解 CAR-T 细胞的特定细胞状态,研究人员使用了两种组合方法(图 2A)来进行鉴别:通过计算机生成全长RNA测序片段的全新转录组(用于含修饰慢病毒基因的CAR-T细胞),以及靶向扩增整合慢病毒基因(用于含未修饰慢病毒基因的CAR-T细胞)。从所有15例患者的不同时间点共鉴定出100 157个CAR-T细胞(图2B)。单细胞 CAR-T 细胞注释与 CAR-T 细胞的流式细胞术染色相关(补图 1)。无论使用哪种产品,CD8 + CAR-T 细胞的比例在输注后 30 天内均占主导地(图 2C)。

CD4 + CAR-T-幼稚细胞在接受髋关节置换术的参与者中富集(P <0.027;P <0.00084),而骨髓瘤患者的CAR-T细胞和非CAR-T细胞富集了GZMB CD8 + 效应T细胞(P=0.027;P=0.015)。在使用不同CAR-T细胞产品的患者中,CD8 + 效应CAR-T细胞和CD4 + CAR-T细胞(幼稚或效应记忆)的分布无显著统计学差异。值得注意的是,CD4 + 和CD8 + CAR T细胞的基尼指数(与TCR克隆性相关)均低于非CAR-T细胞(分别为P=0.0064 和P <0.001;图2E)。比较 CAR-T 细胞的扩增克隆(≥2个具有相同TCR序列的细胞)发现,CD8 + CAR-T 细胞的克隆扩增程度高于 CD4 + CAR-T 细胞(P<0.001;图 2F)。

图2 15例骨髓瘤患者的CAR-T细胞注释、细胞状态和 TCR 克隆

(A)通过全新转录组和定向扩增对CAR-T细胞进行注释的方案;(B)690 939 个带有注释CAR-T细胞投影的T细胞的UMAP(n=100 157)。(C)随时间变化的 CD4 + 和CD8 + CAR-T细胞比例(平均值±标准差 [SE]);(D)条形图显示注释CAR-T细胞状态的比例。显著性水平通过Wilcoxon秩和检验确定(P<0.001);(E) 按CD4 + 和CD8 + 划分的非CAR-T细胞和 CAR-T细胞随时间变化的基尼系数(平均值±SE)。基线代表CAR-T细胞输注前;早期代表输注后第14天和第30天;晚期代表输注后≥90天;(F) 按CD4 + 和CD8 + 划分的CAR-T细胞扩增克隆型(>1个细胞中有相同的TCR克隆型)饼图。

MAIT:粘膜相关恒定T细胞;NKT:自然杀伤T细胞。


根据临床结局对体内CAR-T细胞进行纵向分析

为了探究早期复发患者与CAR-T细胞输注后获得持久缓解的患者之间的异同,将患者分为两组:短暂缓解组(TRs)和持久缓解组(DRs)。根据国际骨髓瘤工作组标准进行疗效评估。在将患者划分为DR组时,以患者至少保持6个月的部分缓解、未出现受累轻链升高或转为微小残留病(MRD)阳性为标准。患者一般都接受过大量前期治疗,中位抗骨髓瘤治疗线数为6(表 1)。TR组患者在第180天时血清游离相关轻链水平升高(P=0.0113;图3A)。

总体而言,CAR-T细胞是异质性的,在所有T细胞簇中均有体现(图 3B、D)。在TR组,CAR-T细胞在第90天和第180天减少了100倍以上,而在DR组,CAR-T细胞在第90天减少了不到1倍,在第180天减少了100倍以上(图3C)。DR组的CAR-T细胞富集于CD8 + 效应记忆细胞状态(P=0.030;图3D)。比较DR组和TR组CD4 + 和CD8 + CAR-T细胞区系的DGE。虽然在CD8 + 细胞群中,只有 HAVCR2 基因(编码T细胞免疫球蛋白和黏蛋白结构域的蛋白3 [TIM3])在TR组中显著升高(P=0.00011; log 2 FC=1.1),而在TR组的 CD4 + 细胞中, HAVCR2 TIGIT 均显著升高(分别为 P<0.001; log 2 FC=1.8和P< 0.001; log 2 FC=1.6),细胞毒性标志物 NKG7 和 PRF1 也显著升高(分别为 P=0.0013 和 P<0.001)(图1F和3E)。

图3 分析CAR-T细胞转录程序与临床反应的相关性

(A)CAR-T细胞治疗后(第0天=CAR-T细胞输注),骨髓瘤患者血清游离轻链(FLC)水平随时间变化的情况,按组别分列。统计意义以星号标出,通过Wilcoxon秩和检验确定(P=0.0113);(B) T细胞的UMAP,以及输注后不同时间点(天)TR组和DR组 CAR-T 细胞的投影;(C)条形图显示输注后不同时间点(天数),按组别分组的15例患者的CAR-T细胞总数;(D)条形图显示各组不同细胞状态下CAR-T细胞的比例(平均值±SE)。统计显著性以星号标出,并通过Wilcoxon秩和检验确定(P=0.030);(E)火山图显示不同患者组(DR vs TR)CD4 + CAR-T 细胞和CD8 + CAR-T细胞中的差异表达基因。红色注释基因的倍数变化 (FC) >1.5 具有统计学意义(P<0.05);(F) 点阵图显示各组CD4 + 和CD8 + CAR-T细胞中细胞毒性和耗竭基因的标准化表达。点图大小与细胞比例成正比。



耗竭的细胞毒性CD4 + CAR-T 细胞与短暂临床缓解相关

为了阐明CAR-T细胞的细胞毒性基因和耗竭基因的性质,研究人员计算了每个注释CAR-T细胞的细胞毒性评分和耗竭评分。在密度图中绘制两组患者的单个CAR-T细胞评分显示,在输注后早期(14~30天),TR组患者的CD4 + 细胞毒性耗竭细胞比DR组患者更富集(Wilcoxon秩和检验,P=0.0303),而不像CD8 + 细胞(Wilcoxon秩和检验,P=0.196;图4A-B)。非CAR驻留CD4 + (P=0.392)或CD8 + T细胞(P=0.26)的耗竭或细胞毒性特征没有差异。

图4 携带干扰素γ标记的细胞毒性和衰竭的CD4 + CAR-T细胞在对治疗有短暂缓解的患者中优先被识别出来

(A) 各组CD4 + 和CD8 + CAR-T细胞的细胞毒性和耗竭基因特征评分密度图。每个象限均标注了细胞分数(%);(B)条形图显示右上角象限的 “双阳性 ”细胞毒性和耗竭细胞的CD4 + CAR-T细胞比例(平均百分比±SE)。统计意义以星号标出,通过Wilcoxon秩和检验确定(P=0.03);(C)箱形图显示各组CAR-Treg 的比例(中位数%±1.5 四分位距);(D)DR组与TR组CD4 + CAR-T细胞干扰素γ(IFNG)通路的富集评分;(E)点阵图显示各组CD4 + CAR-T细胞中干扰素(IFNG)通路相关基因的标准化表达。点图大小与细胞比例成正比。


最近有报道称,输注产品中的CAR-T调节性细胞(CAR-Tregs)与抗CD19 CAR-T细胞治疗后大B细胞淋巴瘤的复发有关。由于CAR-Tregs是CD4 + ,那么在骨髓瘤队列中,CD4 + CAR-T细胞与早期复发之间的关联是否可归因于CAR-Tregs。研究发现,TR组中CAR-Treg的比例并没有增加(图 4C)。研究进一步鉴定了耗竭的细胞毒性 CD4 + CAR-T 细胞是幼稚细胞还是效应记忆细胞,它们在 IFNG 特征中富集(标准化富集评分,-1.33;P<0.001;FDR=0.082;图 4D)。DGE分析证实了特异性IFNG通路基因( IFNGR1 IFNGR2 JAK1 STAT1 IRF1 )在TR组中的富集(图 4E)。


TGF-β促进CD4 + CAR-T细胞耗竭

为了解骨髓瘤微环境中的其他免疫细胞是否会影响CAR-T细胞状态或其杀伤骨髓瘤细胞的能力,对接受髋关节置换术的参与者和接受CAR-T细胞治疗的骨髓瘤患者的BM中的CD45 + CD19 - CD3 - 细胞进行了新鲜分选。对CD14 + 细胞进行了计算机分选,并在过滤和批次校正后对细胞进行了聚类。BM中的CD14 + 细胞由11个细胞簇组成,包括经典型和浆细胞样树突状细胞、CD163+巨噬细胞、表达 VCAN FCN1 S100A8 的5种不同单核细胞亚型以及CD68 + CD16 + 非经典型单核细胞(图5A-B)。







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