本期为大家推送的文章来自《中国药科大学学报》2020年51卷第2期的一篇论文——雷公藤红素联合用药对HepG2细胞增殖的抑制作用。
摘要：研究雷公藤红素分别与甘草次酸、紫杉醇、大黄酸联合用药对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用。采用MTT法，测定并计算雷公藤红素分别与甘草次酸、紫杉醇、大黄酸联用后HepG2细胞的存活率。同时检测细胞凋亡情况以及细胞周期阻滞情况。结果表明，单独应用雷公藤红素、甘草次酸、大黄酸、紫杉醇均可抑制HepG2细胞增殖；雷公藤红素分别与甘草次酸、紫杉醇、大黄酸联用，能显著增强雷公藤红素对HepG2细胞增殖抑制效果，联合用药在一定浓度范围内呈现良好协同作用；联合用药使HepG2细胞凋亡率显著提高（P<0.01），并使更多HepG2细胞阻滞于G2/M期。雷公藤红素与甘草次酸、紫杉醇、大黄酸联用对HepG2细胞的增殖具有良好的协同抑制效果，其与共同诱导凋亡及增加细胞G2/M期阻滞相关。
关键词：雷公藤红素；大黄酸；紫杉醇；甘草次酸；HepG2细胞；联合用药；协同作用
雷公藤红素（Cela）是中药雷公藤的有效成分之一，是一种天然的蛋白酶体抑制剂，具有免疫调节、抗炎、抗肿瘤等多种药理作用。近年来研究表明，Cela可抑制多种肿瘤的引发、转移和增殖，对胰腺癌、胃癌、前列腺癌等均有较好疗效。大黄酸（Rh）、紫杉醇（PTX）和甘草次酸（GA）均具有抗肝癌活性，它们均可以通过诱导细胞凋亡以及阻滞细胞周期来抑制HepG2细胞增殖。有实验表明Rh、GA具有保肝作用，可以降低药物带来的肝损伤；PTX为临床一线抗肿瘤药，临床研究表明其与其他药物联用能达到对肝癌更好的治疗效果。综上考虑，本研究希望探索一种以Cela为主的联合给药系统，在达到良好的抗肝癌效果的同时减少对正常组织的副作用。因此，本研究采用MTT法考察了Cela分别与Rh、PTX、GA3种中药有效成分联用对HepG2细胞增殖抑制的影响，根据药物协同指数、金氏公式、凋亡检测、细胞周期检测分析Cela分别与Rh、PTX、GA联用时对HepG2细胞增殖抑制作用效果，以期未来为Cela联合用药、增效减毒以及剂型设计奠定研究基础。
单独应用Cela对HepG2细胞增殖抑制的实验中，各浓度Cela处理细胞48h后，细胞存活率见图１-A。结果显示，Cela在质量浓度低时对HepG2细胞增殖无明显抑制作用，随着质量浓度的升高，抑制作用明显加强，呈明显剂量依赖性；Cela质量浓度为0.75和1ug/ml时，细胞存活率与空白对照组相比具有显著差异（P<0.05），Cela质量浓度为2.5和5ug/ml时，细胞存活率与空白对照组相比具有极显著差异（P<0.001）。
单独使用Rh、PTX、GA作用于HepG2细胞，给药后48h后，细胞存活率结果分别如图1-B、1-C和1-D所示，Rh、PTX、GA均可以抑制HepG2细胞增殖，细胞生长抑制率随着Rh、PTX、GA质量浓度增加而增加的趋势，呈现一定剂量依赖性。根据Rh、PTX、GA抑制HepG2细胞增殖的存活率图，最终选用协同药物质量浓度分别为：Rh1、10、20ug/ml；PTX0.1、10、20ug/ml；GA1、5、10ug/ml。
Cela与Rh、PTX、GA联合用药对肿瘤细胞增殖抑制的结果见图２。结果表明，Cela与Rh联合用药时，Rh在20ug/ml质量浓度时，Cela＋Rh组在Cela0.01、0.1、0.25ug/ml质量浓度时对HepG2细胞的增殖抑制作用效果是Cela单独使用的５倍；Cela＋PTX联合用药组在Cela0.01、0.1、0.25ug/ml质量浓度时抑制HepG2细胞增殖的效果比Cela单独用药组高出10倍以上，抑制作用呈质量浓度依赖性，Cela低质量浓度时增殖抑制效果更优；Cela＋GA联合用药组与Cela单用组相比，10ug/mlＧＡ与Cela合用48h，抑制率由Cela单独用药组的（4.70±5.67）%-（90.40±1.48）%提高到（25.36±4.02）%-（95.86±0.45）%，低浓度时抑制作用更明显。以上结果说明Cela单用仅在高质量浓度时对HepG2细胞有明显增殖抑制作用，Rh、PTX、GA均有增强Cela对HepG2细胞增殖抑制作用的效果，并且在Cela低质量浓度时增强作用更好，联合用药组比Cela单用组细胞增殖抑制效果更优。
非线性回归计算Cela单用及各药物联用组用于HepG2细胞48h后的IC50（表１）显示，与Cela单独使用时IC50相比，Cela分别与20ug/mlRh和10ug/mlGA联用时，IC50明显降低，Cela与0.1、10、20ug/mlPTX联用后，IC50皆有明显降低。说明Cela与PTX联用对HepG2细胞增殖抑制作用更佳。实验采用协同指数法以及金氏公式对Cela分别与Rh、PTX、GA之间的相互作用类型（相加性、协同性或拮抗性）进行了评价，并绘制了Fa-CI图（见图３）。结果表明，Cela质量浓度为0.01-0.5ug/ml时，Cela分别与Rh、GA联合用药组均表现为拮抗作用，随着Cela质量浓度增大，联合用药组CI<1，q>0.85（ｑ值见表１），且绝大部分CI<0.7、q>1.15，表现出显著协同以及相加作用；Cela与PTX合用时，当两者都处于低浓度时表现为拮抗作用，随着两药的浓度增大，表现出协同作用，尤其是PTX质量浓度增大到20ug/ml后，协同作用非常显著。由Fa-CI图可看出，联合用药组在较宽浓度范围内，CI始终低于１，表明Cela与Rh、PTX、GA联用的协同效果良好。
采用AnneinV-FITC/PI标记法结合流式细胞仪检测，Cela、Rh、PTX、GA单独用药和Cela与Rh、PTX、GA联合用药组作用于HepG2细胞48h后，细胞凋亡率（图４）结果显示，单独使用Cela0.5ug/ml、Rh10ug/ml、PTX0.1ug/ml、GA10ug/ml作用于HepG2细胞48h时，细胞凋亡率分别为（9.67±0.60）%、（10.43±0.93）%、（23.33±1.20）%和（5.40±0.95）%。GA10ug/ml、PTX0.1ug/ml、Rh10ug/ml分别与Cela0.5ug/ml合用48h后，细胞凋亡率均提高，Cela＋Rh、Cela＋PTX、Cela＋GA依次为（23.50±2.91）%、（57.57±2.34）%和（11.77±0.32）%。结果显示４种药物均可诱导细胞凋亡，联合用药组细胞凋亡率显著提高，差异均有统计学意义（P<0.01）。
将HepG2细胞分别用Cela、Rh、PTX、GA、Cela＋Rh、Cela＋PTX、Cela＋GA干预24h后，采用流式细胞仪检测细胞周期分布，并在细胞G0/G1期、S期和G2/M期观察分析数据（图５）。结果表明，HepG2细胞在药物干预下，周期发生明显变化，Cela、GA、PTX单独处理组可引起G2/M期阻滞，Rh单独处理组可引起G0/G1期阻滞。而联合用药组的G0/G1期细胞百分率明显减少，S期和G2/M期细胞比例相应地增加，说明联合用药组使得细胞更多地阻滞于G2/M期，进而抑制细胞增殖。
Cela是一种具有潜力的抗肿瘤药物，Cela具有全身性不良反应，如心脏毒性、肾毒性、生殖毒性等，胃肠道反应严重。为解决其不良反应大的缺陷，本研究从抑制肿瘤细胞增殖的角度考虑，以具有抗肿瘤作用的中药有效成分GA、PTX、Rh与其联合应用，以期通过减少用量或在制备新型制剂时实现肝靶向、减轻不良反应的同时获得更好的临床治疗效果的目的，为Cela的临床应用探索新路。综上，Cela分别与GA、PTX、Rh联用，为Cela增效减毒、制剂设计以及临床应用提供了可行的方案。
本文引用：张雪,欧阳惠枝,徐伟,王晓颖.雷公藤红素联合用药对HepG2细胞增殖的抑制作用[J].中国药科大学学报,2020,51(2):185-192.
美编：贺慧勤
终审：陈玲 顾凯 邹栩
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