被基质细胞改变的卵巢癌

     通过电子微镜qNano分析证实了外泌体的双层膜特征和大小（图1a，b）；蛋白印迹分析显示外泌体有标志物CD63和HSP70，但是缺乏顺式 -高尔基体特异性标志物GM130（图1c）；

    (图1d)热图显示了从4种卵巢癌、2种正常成纤维细胞NF、3种CAF、2种正常脂肪细胞NA、2种CAA分离的外泌体中小RNA的相对表达量：基质细胞（包括正常和肿瘤相关的成纤维细胞及脂肪细胞）中的Mature miR-21和Mature miR-21 5′ super variant含量均比肿瘤细胞高，且CAA中上述两者的拷贝数最高（表1）；

    miRNA-seq和qRT-PCR检测数据之间存在高度一致性：与卵巢癌细胞相比，在四种基质细胞类型中三种miR21变体显示出较高的表达水平；Mature 5'-miR21的表达水平在CAAs和卵巢癌细胞之间具有最大的倍数差异，而前体变体 precursor variant 在CAF和卵巢癌细胞之间具有最大的折叠差异（图1e，f）。

    作者从图a中5种细胞类型的原代细胞分离的RNA进行了qRT-PCR分析。结果表明，CAA和CAF表达的内源性miR21水平明显高于卵巢癌细胞和正常的基质细胞（图2a）；

     用qRT–PCR 分析了图中显微切割的6种细胞类型（包括原位肿瘤和网膜肿瘤），进一步证实了基质和上皮性卵巢癌之间miR21的表达差异，且网膜肿瘤高于原位肿瘤的表达（图2b）；

    （图c-f）作者对独立的组织样本进行了原位杂交。正常的网膜脂肪细胞(NA 图2c)和成纤维细胞(NF 图2d）miR21的表达水平最低。此外，肿瘤细胞中miR21表达最多的部位在基质 - 上皮交接和侵袭前端（图2e-g），提示了此处miR21升高的机制可能为相邻基质细胞分泌介质调节或者直接转染；

    （图2h-k）miR21的表达在网膜肿瘤中高于原位肿瘤(h)；复发性卵巢癌明显高于原发性卵巢癌(i)；耐药细胞系(HeyA8 MDR和SKOV3TR)高于敏感细胞系(j)；铂类治疗后的细胞系(PEA2)高于原位肿瘤([PEA1)(k)。

     共聚焦显微镜显示：与CAF和CAA（图3a）或者上述来源外泌体（图3b）共培养的癌细胞中检测到荧光标记的miR21，但在对照组的癌细胞中检测不到，表明miR21确实从CAA和CAF转移到癌细胞，且通过外泌体转染（图3a）；

    （图3c-h）为了确定体内也存在miR21的转移作用，作者将红色mCherry标记的卵巢癌SKOV3ip细胞（c）皮下注射到裸鼠中。肿瘤结节形成后，用FAM标记的miR21瞬时转染miR21- / miR21-小鼠胚胎成纤维细胞（miR21- / miR21- MEFs）（d），并注射到肿瘤结节附近。注射24 小时后制备肿瘤冷冻切片。圆形核的蓝色信号，表明存在完整的细胞（e）。在非固定冷冻切片中显示为红色mCherry标记的颗粒结构为卵巢癌细胞（f）。在周边基质细胞及一些癌细胞中观察到表达miR21分子的绿色FAM标记信号（图3g，h）。这些结果表明miR21可以在体内从成纤维细胞转移到癌细胞。

     （图4a-c）作者从miR21- / miR21- MEFs和miR21 + / miR21 + MEFs中分别分离外泌体，由qNano定量（a）；并且将外泌体加入到两种卵巢癌细胞系OVCA432和SKOV3中。相比对照组miR21- / miR21- MEF外泌体，在miR21 + / miR21 + MEF外泌体处理的细胞中miR21的水平显着升高（b），且癌细胞的生存率增加（c）；

     作者用前体miR21（pre-miR21）或阴性对照直接转染OVCA432和SKOV3卵巢癌细胞，并用紫杉醇处理它们。用前体miR21转染的细胞的化疗敏感性和癌细胞凋亡率，比对照组显着降低（d、e）；

     为了证明miR21在体内的作用，将荧光标记的卵巢癌SKOV3ip细胞与miR21-MEF或MEF共同注入雌性裸鼠，再以最佳剂量的紫杉醇（7.5nM）处理。单独的SKOV3ip细胞注射作为阴性对照。显示SKOV3ip细胞单独组和MEF组的荧光素酶活性均显着低于miR21-MEF组，这表明miR21-MEF组中的肿瘤细胞对紫杉醇更具抗性（图4f，g）。   

    （图5a-b）热图显示了与化学耐药和转移相关最强的前10个miR21调控基因 （a）。通路分析显示在miR21转染的SKOV3细胞中上调（红色）或下调（绿色）的化学抗性相关基因（b）。 其中APAF1被筛选用于进一步研究。

    （图5c-g）与CAA和CAF来源外泌体共培养的SKOV3细胞的APAF1表达低于对照组（c）。免疫定位显示：卵巢肿瘤组织中在基质 - 上皮交界上APAF1水平较低，此处为miR21较高水平部位（d）。用前体miR21转染的卵巢癌细胞的APAF1 mRNA（e）和蛋白水平（f）均低于对照组。使用Spearman相关分析确定显微解剖卵巢癌组织中miR21和APAF1 mRNA水平之间的负性相关性（g）。

    （图5h-k）APAF1的表达水平在复发性卵巢癌细胞PEA2中较低（h）。在APAF1的编码序列内发现与miR21一致的结合位点（i），表明APAF1为miR21在受体癌细胞中的靶点。共转染了不同量的前体miR21和带有APAF1编码序列的荧光载体到SKOV3卵巢癌中，发现其荧光素酶表达量以剂量依赖的方式下降(h)。但是使用了突变型APAF1后，前体miR21对APAF1的荧光活性没有了在这种作用（k）。      

    全长转染的APAF1过表达后，增加了卵巢癌细胞中的紫杉醇敏感性（图6a）。前体miR21和全长APAF1的共转染，相比仅有miR21转染的对照组而言，部分降低了卵巢癌的紫杉醇耐药性（图6b）。

    为了评估APAF1对体内卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的影响，作者建立了稳定表达多西环素诱导型APAF1或对照空载体的OVCA432细胞，并将其腹膜内注射入雌性裸鼠，随后进行紫杉醇处理。结果表明，APAF1过表达组的荧光素酶活性显着低于对照组（图6c，d）。使用免疫组织化学分析证实APAF1过表达组肿瘤组织中APAF1表达的升高（图6e）。