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被基质细胞改变的卵巢癌

exosomes  · 公众号  · 医学  · 2017-07-17 22:41

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经外泌体转染的基质来源miR21通过靶点APAF1,导致卵巢癌细胞产生紫杉醇耐药


Abstraction

晚期卵巢癌通常向网膜的内脏脂肪组织转移。但是调节卵巢癌生长的网膜基质细胞来源的分子因素尚未得到验证。这里,利用下一代测序技术,我们鉴别出从肿瘤相关脂肪细胞(CAAs)和成纤维细胞(CAF)分离的外泌体和组织裂解物,比卵巢癌细胞中有更高的miRNA21异源异构体。功能研究表明,miR21从CAAs或CAF转移到癌细胞中,转移后它抑制卵巢癌细胞凋亡,并且通过与其直接新靶点APAF1结合赋予癌细胞化学耐药性。这些数据表明,转移性卵巢癌细胞的恶性表型可以通过源自网膜肿瘤微环境中相邻基质细胞的外泌体递送的miR21而发生改变,因此抑制基质来源miR21的转移是治疗转移性和复发性卵巢癌的另外一种可能机制。


Results

· CAF和CAA外泌体拥有较高的miR21的拷贝数。

通过电子微镜 qNano分析证实了外泌体的双层膜特征和大小(图1a,b) 蛋白印迹分析显 示外泌体有标志物 CD63和HSP70,但 是缺乏顺式 -高尔 基体特异性标志物 GM130(图1c)

(图1d)热图显示了从4种卵巢癌、2种正常成纤维细胞NF、3种CAF、2种正常脂肪细胞NA、2种CAA分离的外泌体中小RNA的相对表达量:基质细胞(包括正常和肿瘤相关的成纤维细胞及脂肪细胞)中的 Mature miR-21和 Mature miR-21 5′ super variant含量均比肿瘤细胞高,且CAA中上述两者的拷贝数最高(表1)

miRNA-seq和qRT-PCR检测数据之间存在高度一致性:与卵巢癌细胞相比, 在四种基质细胞类型中 三种miR21变体显示出较高的表达水平;Mature 5'-miR21的表达水平在CAAs和卵巢癌细胞之间具有最大的倍数差异,而前体变体 precursor variant 在CAF和卵巢癌细胞之间具有最大的折叠差异(图1e,f)。


·在基质和肿瘤组织中 miR21的表达水平不同

作者从图a中5种细胞类型的原代细胞分离的RNA进行了qRT-PCR分析。结果表明,CAA和CAF表达的内源性miR21水平明显高于卵巢癌细胞和正常的基质细胞(图2a)

用qRT–PCR 分析了图中显微切割的6种细胞类型(包括原位肿瘤和网膜肿瘤),进一步证实了基质和上皮性卵巢癌之间miR21的表达差异,且网膜肿瘤高于原位肿瘤的表达(图2b)

(图c-f )作者对独立的组织样本进行了原位杂交。正常的网膜脂肪细胞(NA 图2c)和成纤维细胞(NF 图2d)miR21的表达水平最低。 此外,肿瘤细胞中miR21表达最多的部位在基质 - 上皮交接和侵袭前端(图2e-g),提示了此处miR21升高的机制可能为相邻基质细胞分泌介质调节或者直接转染

(图2h-k)miR21的表达在网膜肿瘤中高于原位肿瘤(h); 复发性卵巢癌 明显高于原发性卵巢癌(i);耐药细胞系(HeyA8 MDR和SKOV3TR)高于敏感细胞系(j);铂类治疗后的细胞系(PEA2)高于原位肿瘤([PEA1)(k)。


· 将miR21从CAF和CAA直接转移到癌细胞

共聚焦显微镜显示:与CAF和CAA(图3a)或者上述来源外泌体(图3b)共培养的癌细胞中检测到荧光标记的miR21,但在对照组的癌细胞中检测不到,表明miR21确实从CAA和CAF转移到癌细胞,且通过外泌体转染(图3a)

(图3c-h)为了确定体内也存在miR21的转移作用,作者将红色mCherry标记的卵巢癌SKOV3ip细胞(c)皮下注射到裸鼠中。肿瘤结节形成后,用FAM标记的miR21瞬时转染 miR21- / miR21- 小鼠胚胎成纤维细胞( miR21- / miR21- MEFs)(d),并注射到肿瘤结节附近。注射24 小时后制备肿瘤冷冻切片。圆形核的蓝色信号,表明存在完整的细胞(e)。在非固定冷冻切片中显示为红色mCherry标记的颗粒结构为卵巢癌细胞(f)。在周边基质细胞及一些癌细胞中观察到表达miR21分子的绿色FAM标记信号(图3g,h)。这些结果表明miR21可以在体内从成纤维细胞转移到癌细胞。


· miR21降低癌细胞的化学敏感性和细胞凋亡

(图4a-c)作者从 miR21- / miR21- MEFs和 miR21 + / miR21 + MEFs中分别分离外泌体,由qNano定量(a) 并且将外泌体加入到两种卵巢癌细胞系OVCA432和SKOV3中。相比对照组 miR21- / miR21- MEF外泌体,在 miR21 + / miR21 + MEF外泌体处理的细胞中miR21的水平显着升高(b),且癌细胞的生存率增加(c)

作者用 前体 miR21(pre-miR21)或阴性对照直接转染OVCA432和SKOV3卵巢癌细胞,并用紫杉醇处理它们。用前体miR21转染的细胞的化疗敏感性和癌细胞凋亡率,比对照组显着降低(d、e)

为了证明miR21在体内的作用,将荧光标记的卵巢癌SKOV3ip细胞与miR21-MEF或MEF共同注入雌性裸鼠,再以最佳剂量的紫杉醇 (7.5nM) 处理。单独的SKOV3ip细胞注射作为阴性对照。显示SKOV3ip细胞单独组和MEF组的荧光素酶活性均显着低于miR21-MEF组,这表明miR21-MEF组中的肿瘤细胞对紫杉醇更具抗性(图4f,g)。


·APAF1是癌细胞中miR21的直接下游靶标

(图5a-b)热图显示了与化学耐药和转移相关最强的前10个miR21调控基因 (a)。通路分析显示在miR21转染的SKOV3细胞中上调 (红色) 或下调 (绿色) 的化学抗性相关基因(b)。 其中APAF1被筛选用于进一步研究。

(图5c-g)与CAA和CAF来源外泌体共培养的SKOV3细胞的APAF1表达低于对照组(c)。免疫定位显示:卵巢肿瘤组织中在基质 - 上皮交界上APAF1水平较低,此处为miR21较高水平部位(d)。用前体miR21转染的卵巢癌细胞的APAF1 mRNA(e)和蛋白水平(f)均低于对照组。使用Spearman相关分析确定显微解剖卵巢癌组织中miR21和APAF1 mRNA水平之间的负性相关性(g)。

(图5h-k)A PAF1的表达水平在复发性卵巢癌细胞PEA2中较低(h)。 在APAF1的编码序列内发现与miR21一致的结合位点(i),表明APAF1为miR21在受体癌细胞中的靶点。 共转染了不同量的前体miR21和带有APAF1编码序列的荧光载体到SKOV3卵巢癌中,发现其荧光素酶表达量以剂量依赖的方式下降(h )。但是使用了突变型APAF1后,前体miR21对APAF1的荧光活性没有了在这种作用(k)。


·APAF1是癌细胞中miR21的直接下游靶标

全长转染的APAF1过表达后,增加了卵巢癌细胞中的紫杉醇敏感性(图6a)。前体miR21和全长APAF1的共转染,相比仅有miR21转染的对照组而言,部分降低了卵巢癌的紫杉醇耐药性(图6b)

为了评估APAF1对体内卵巢癌细胞紫杉醇耐药性的影响,作者建立了稳定表达多西环素诱导型APAF1或对照空载体的OVCA432细胞,并将其腹膜内注射入雌性裸鼠,随后进行紫杉醇处理。结果表明,APAF1过表达组的荧光素酶活性显着低于对照组(图6c,d)。使用免疫组织化学分析证实APAF1过表达组肿瘤组织中APAF1表达的升高(图6e)。


Suggestion

本研究结果表明,从相邻基质细胞来源的外泌体可以通过的转染miR21而赋予卵巢癌细胞化学抗性和侵袭性表型,这表明防止从基质细胞到卵巢癌细胞的miR21外泌体转移是抑制卵巢癌生长的新策略。此外,APAF1作为miR21的直接靶点以调节癌细胞的耐药性,提示基于卵巢癌细胞中APAF1上调的策略可用于使卵巢癌细胞对紫杉醇治疗敏感。











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