被基质细胞改变的卵巢癌

通过电子微镜 qNano分析证实了外泌体的双层膜特征和大小（图1a，b） ； 蛋白印迹分析显 示外泌体有标志物 CD63和HSP70，但 是缺乏顺式 -高尔 基体特异性标志物 GM130（图1c） ；

(图1d)热图显示了从4种卵巢癌、2种正常成纤维细胞NF、3种CAF、2种正常脂肪细胞NA、2种CAA分离的外泌体中小RNA的相对表达量：基质细胞（包括正常和肿瘤相关的成纤维细胞及脂肪细胞）中的 Mature miR-21和 Mature miR-21 5′ super variant含量均比肿瘤细胞高，且CAA中上述两者的拷贝数最高（表1） ；

miRNA-seq和qRT-PCR检测数据之间存在高度一致性：与卵巢癌细胞相比， 在四种基质细胞类型中 三种miR21变体显示出较高的表达水平；Mature 5'-miR21的表达水平在CAAs和卵巢癌细胞之间具有最大的倍数差异，而前体变体 precursor variant 在CAF和卵巢癌细胞之间具有最大的折叠差异（图1e，f）。

作者从图a中5种细胞类型的原代细胞分离的RNA进行了qRT-PCR分析。结果表明，CAA和CAF表达的内源性miR21水平明显高于卵巢癌细胞和正常的基质细胞（图2a） ；

用qRT–PCR 分析了图中显微切割的6种细胞类型（包括原位肿瘤和网膜肿瘤），进一步证实了基质和上皮性卵巢癌之间miR21的表达差异，且网膜肿瘤高于原位肿瘤的表达（图2b） ；

（图c-f ）作者对独立的组织样本进行了原位杂交。正常的网膜脂肪细胞(NA 图2c)和成纤维细胞(NF 图2d）miR21的表达水平最低。 此外，肿瘤细胞中miR21表达最多的部位在基质 - 上皮交接和侵袭前端（图2e-g），提示了此处miR21升高的机制可能为相邻基质细胞分泌介质调节或者直接转染 ；

（图2h-k）miR21的表达在网膜肿瘤中高于原位肿瘤(h)； 复发性卵巢癌 明显高于原发性卵巢癌(i)；耐药细胞系(HeyA8 MDR和SKOV3TR)高于敏感细胞系(j)；铂类治疗后的细胞系(PEA2)高于原位肿瘤([PEA1)(k)。

共聚焦显微镜显示：与CAF和CAA（图3a）或者上述来源外泌体（图3b）共培养的癌细胞中检测到荧光标记的miR21，但在对照组的癌细胞中检测不到，表明miR21确实从CAA和CAF转移到癌细胞，且通过外泌体转染（图3a） ；

（图3c-h）为了确定体内也存在miR21的转移作用，作者将红色mCherry标记的卵巢癌SKOV3ip细胞（c）皮下注射到裸鼠中。肿瘤结节形成后，用FAM标记的miR21瞬时转染 miR21- / miR21- 小鼠胚胎成纤维细胞（ miR21- / miR21- MEFs）（d），并注射到肿瘤结节附近。注射24 小时后制备肿瘤冷冻切片。圆形核的蓝色信号，表明存在完整的细胞（e）。在非固定冷冻切片中显示为红色mCherry标记的颗粒结构为卵巢癌细胞（f）。在周边基质细胞及一些癌细胞中观察到表达miR21分子的绿色FAM标记信号（图3g，h）。这些结果表明miR21可以在体内从成纤维细胞转移到癌细胞。

（图4a-c）作者从 miR21- / miR21- MEFs和 miR21 + / miR21 + MEFs中分别分离外泌体，由qNano定量（a） ； 并且将外泌体加入到两种卵巢癌细胞系OVCA432和SKOV3中。相比对照组 miR21- / miR21- MEF外泌体，在 miR21 + / miR21 + MEF外泌体处理的细胞中miR21的水平显着升高（b），且癌细胞的生存率增加（c） ；

作者用 前体 miR21（pre-miR21）或阴性对照直接转染OVCA432和SKOV3卵巢癌细胞，并用紫杉醇处理它们。用前体miR21转染的细胞的化疗敏感性和癌细胞凋亡率，比对照组显着降低（d、e） ；

为了证明miR21在体内的作用，将荧光标记的卵巢癌SKOV3ip细胞与miR21-MEF或MEF共同注入雌性裸鼠，再以最佳剂量的紫杉醇 （7.5nM） 处理。单独的SKOV3ip细胞注射作为阴性对照。显示SKOV3ip细胞单独组和MEF组的荧光素酶活性均显着低于miR21-MEF组，这表明miR21-MEF组中的肿瘤细胞对紫杉醇更具抗性（图4f，g）。