β-葡萄糖苷酶是纤维素酶系的重要组分，该酶可将纤维二糖降解为葡萄糖，同时减少纤维二糖对纤维素酶的抑制。因此，高催化能力的β-葡萄糖苷酶对木质纤维素降解转化具有重要意义。在纤维素酶解过程中，固体底物对纤维素酶的吸附是影响酶解效率的重要因素。通过理性设计蛋白结构改变其与底物的结合性质可构建得到高催化能力的纤维素酶，如内切纤维素酶（EGs）和纤维二糖降解酶（CBH）。但由于β-葡萄糖苷酶的催化底物是游离的纤维二糖，研究者对β-葡萄糖苷酶与固体底物（木质素和纤维素）的结合行为关注较少。在纤维素酶解过程中，固体底物对β-葡萄糖苷酶具有吸附作用，并有研究报道β-葡萄糖苷酶与木质素的结合会降低其催化效率，引起纤维二糖的积累，增强纤维二糖对CBH的抑制作用。在我们前期研究中也发现草酸青霉分泌的β-葡萄糖苷酶Bgl1对微晶纤维素具有强的结合作用，但该结合作用如何影响酶解效率，目前未见报道。
针对上述问题，
山东大学微生物技术研究院赵建教授团队在研究β-葡萄糖苷酶与固体底物（木质素和纤维素）结合机理的基础上，通过理性设计蛋白结构，改变β-葡萄糖苷酶与固体底物的结合行为，提高了β-葡萄糖苷酶的催化效率。研究为β-葡萄糖苷酶的理性改造提供了新的视角。
研究选取草酸青霉分泌的β-葡萄糖苷酶Bgl1和烟曲霉来源的β-葡萄糖苷酶Bgl3为研究对象。研究发现这两种酶在木质素和微晶纤维素上的吸附行为存在明显差异：Bgl1与微晶纤维素的结合能力较强而与木质素的结合能力较弱，可溶性酚类物质对该酶的活性表现出较强的抑制作用；Bgl3在纤维素上的吸附能力较弱，而木质素则对其表现出强的吸附能力，且该酶对游离的酚类物质不敏感。通过生物信息学方法对β-葡萄糖苷酶与木质素和纤维素的结合位点、结合能及蛋白表面性质等的解析，发现FnIII结构域是引起β-葡萄糖苷酶与固体底物结合性质差异的原因。Bgl3的FnIII结构域（FnIII-3）与木质素通过静电作用结合，并可与催化结构域竞争性结合酚类小分子，从而减少可溶性酚类小分子对酶活性的影响。而Bgl1的FnIII结构域在其与木质素的结合中起到的作用不显著，而且Bgl1与木质素的结合可能会影响其与纤维二糖底物的结合，从而影响Bgl1的降解效率。
图 1 β-葡萄糖苷酶Bgl1与Bgl3与木质素（图A）和纤维素（图B）的吸附前（条带C），吸附后（条带A）和解吸附后（条带D）β-葡萄糖苷酶活性的变化
FnⅢ 结构域是β-葡萄糖苷酶的组成部分，不参与酶的催化过程，但上述结果表明FnIII结构域在蛋白与固体底物结合中具有重要作用，基于此提出如下假设，即通过改变β-葡萄糖苷酶蛋白的FnIII结构域来降低其与固体底物结合能力，从而增加其对纤维二糖的催化降解效率。为证实上述假设，进一步构建了两个嵌合蛋白Bgl1-3（Bgl1催化结构域与Bgl3的FnⅢ结构域融合）和Bgl3-1（Bgl3催化结构域与Bgl1的FnⅢ结构域融合），通过研究它们与纤维素和木质素的结合行为及其对木质纤维素的酶解能力，证明通过理性改造β-葡萄糖苷酶的FnIII结构域可以减少蛋白与木质素和微晶纤维素的结合，同时可溶性酚对Bgl1的抑制作用也明显降低；在纤维素酶中添加嵌合蛋白，纤维素底物特别是含木质素的纤维素底物如水热预处理玉米秸秆的酶解效率明显增加，这是因为嵌合蛋白可高效转化酶解液中的纤维二糖成葡萄糖，从而促进酶解的进行。
图2 嵌合蛋白Bgl1-3和Bgl3-1对木质素（条带L）和纤维素（条带A）与吸附前（条带C）相比酶活的变化
β-葡萄糖苷酶与不溶性底物的结合不利于其在木质纤维素酶解过程中对可溶性底物纤维素二糖的催化作用。通过改造β-葡萄糖苷酶与木质素和纤维素的结合行为，可以提高β-葡萄糖苷酶的水解效率，其中改造后的β-葡萄糖苷酶在水热预处理玉米秸秆的水解体系中表现出对纤维二糖更高的水解能力和对酚类物质更低的敏感性。这为提升β-葡萄糖苷酶在水解体系中的催化效率提供了一个新的途径。
https://doi.org/10.1016/j.biortech.2023.129974
