微环境其实是一个较为广义的概念，不单单是在某个微小环境中免疫细胞的作用，其实肿瘤细胞对于组织也存在着微环境的互作。今天讲的这篇文章是清华大学医学院郑撼球副教授团队和青岛大学附属医院岳斌教授合作，发表在17.3分的Nature子刊Nat Cell Biol上的文章。这篇文章讲的是微环境中乳腺癌细胞与成骨细胞之间的Crosstalk，还挺有意思：
首先，他们要研究的课题是乳腺癌细胞是如何进行骨转移的，有哪些是骨转移的关键因素，于是他们第一步，就是使用骨转移能力更强的4T1.2细胞，构建了一个小鼠的骨转移模型，然后进行了单细胞测序（下图这种tSNE图，其实就是将多维的PCA降维所产生的，也就是将单细胞测序的结果进行了按照基因表达的差异作为成因进行了分簇，看不懂这图的话，可以回去看看《列文虎克读文献》和《夏老师带你读文献》）。在单细胞测序的结果中可以发现，早期骨转移的细胞和晚期骨转移的细胞其实并不属于同一个细胞簇：
转移早期的增殖相关信号通路以及EMT相关信号通路都会增多（EMT其实就是上皮间质转换的过程，也就是肿瘤细胞迁移侵袭过程中比较重要的信号通路，不清楚的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列复习下），而在骨转移后期溶骨期，则肿瘤细胞产生了EMT的反向变化，也就是由间质细胞转换为上皮细胞表型。
接着，他们就进行了一波cDNA文库的筛选（这个筛选其实和CRISPR筛选相反，可以参考《列文虎克读文献》里的CRISPR筛库，CRISPR筛库是通过随机敲除基因进行的基因筛选，而cDNA文库的筛选，则是基于随机的基因过表达来进行的筛选），通过筛选，他们找到了一些与肿瘤细胞骨转移正相关的基因：
这其中，他们选择了LTβ，为啥选了LTβ呢？是因为它虽然作为免疫相关的基因被研究过，但是在骨转移中并没有过报道。接着他们就对LTβ进行了一系列的柯霍氏法则的验证（其实就是在肿瘤细胞中敲减LTβ后，也就是移除了LTβ这个因素，然后查看肿瘤细胞的骨转移功能，不清楚柯霍氏法则的话，可以看看《轻松的文献导读》和《列文虎克读文献》），结果显示LTβ缺失会抑制肿瘤细胞骨转移进展，也就是说LTβ可能会促进骨转移，但同时不影响原发性肿瘤生长和肺转移：
那说明了LTβ对于肿瘤细胞骨转移的重要性，那要进一步验证LTβ可能会促进骨转移，其实光靠敲减LTβ是不够的。于是他们进行了另一个实验，就是在惰性乳腺癌细胞中，过表达LTβ，所谓的惰性乳腺癌细胞，就是没有骨转移能力的乳腺癌细胞系。他们通过对这样的细胞系过表达LTβ后发现，LTβ可以重新激活惰性乳腺癌细胞的骨转移能力：
那么是不是LTβ促进了肿瘤细胞本身的迁移能力呢？于是他们通过Transwell等实验分析后发现，LTβ不影响癌细胞的迁移和侵袭。而原发性肿瘤中LTβ的表达量较低，同样的肿瘤细胞转移定植到骨组织后LTβ的表达会明显升高。他们发现肿瘤细胞和成骨细胞或间充质干细胞（成骨细胞的祖细胞）共培养，会促进肿瘤细胞的LTβ表达，而使用成骨细胞产生的细胞因子，比如RANKL等也能促进肿瘤细胞LTβ的表达。这也就说明了，肿瘤细胞在骨微环境中会被成骨细胞诱导表达LTβ：
知道了成骨细胞对于肿瘤细胞的LTβ诱导表达，那么作为TNF家族的LTβ对于成骨细胞是不是也有什么影响呢？他们使用人重组的LTα1/β2蛋白处理成骨细胞，然后进行了二代测序（下图的火山图和热图应该都能看懂了吧，这个在《夏老师带你读文献》里也都介绍过了，是看基因差异表达的图）：
结果发现LTβ对成骨细胞的NFκB信号传导会产生激活（不清楚NFκB信号通路的话，这个信号通路和炎症有很密切的关系，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列，都讲过了）。LTβ激活NFκB后，会诱导CCL2、CCL5 和 CXCL10的表达，当使用LTβ抑制后，成骨细胞的CCL2、CCL5 和 CXCL10表达被阻断。而成骨细胞产生的CCL2/5蛋白，也显着增强了肿瘤细胞增殖。这样一来肿瘤细胞和成骨细胞之间的Crosstalk，也就展现出来了。
接着他们继续分析LTβ对于肿瘤细胞对于成骨细胞的细胞粘附，通过体内外实验发现， LTβ可以促进肿瘤细胞粘附和定植到骨组织。刚才也提到LTβ可以促进惰性肿瘤细胞，产生强溶骨性骨转移。而CCL2/5则正巧是参与破骨细胞生成的趋化因子，当他们敲除了巨噬细胞（前破骨细胞）的CCL2/5受体后，阻断了LTβ诱导的肿瘤细胞骨转移，也就是说LTβ可能依赖于CCL2/5介导的巨噬细胞（前破骨细胞）募集和破骨细胞生成来促进骨降解的：
研究做到这里，也就是说LTβ很可能就是一个乳腺癌骨转移的重要靶点，于是他们使用了LTβR-Ig（LTβ诱饵受体）来对骨转移乳腺癌的小鼠模型进行治疗，结果发现LTβR-Ig可以有效抑制骨转移，也就是说LTβ是骨转移的潜在治疗靶点：
最后形成了这样的示意图，首先肿瘤细胞和骨细胞产生Crosstalk的过程中，成骨细胞分泌的RANKL及其他因子，可能会激活肿瘤细胞表达LTβ。而肿瘤细胞产生的LTβ可以激活成骨细胞的NFκB信号通路，导致CCL2/5等趋化因子的表达。肿瘤细胞的LTβ也同时会促进肿瘤细胞对成骨细胞的粘附，从而促进骨定植。另一方面成骨细胞被LTβ诱导产生的CCL2/5，会促进巨噬细胞（前破骨细胞）成为破骨细胞，促进骨降解，也就导致了LTβ诱导的强溶骨性骨转移：
这篇文章从筛选目标基因，到深入研究机制，其实做得还是相当不错的。通过对于LTβ的机制，引申到将其作为乳腺癌骨转移的潜在靶点，其实也增加了研究的应用上的意义。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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