半胱氨酸组织蛋白酶是一个由11种蛋白酶组成的家族，其被认为是治疗癌症和其他疾病（如自身免疫性疾病和骨质疏松症）的潜在治疗靶标。但因其广泛性抑制会引发较为严重的副作用，所以目前还没有靶向该靶点的药物通过临床试验。因此，来自瑞士实验癌症研究所的研究人员创建了一个模块化药物平台，将阻断半胱氨酸蛋白酶活性的非天然肽抑制剂（non-natural peptide inhibitors，NNPIs）与抗体结合，以引导其递送至所需类型的靶细胞，从而创建抗体-肽抑制剂偶联物（antibody-peptide inhibitor conjugates, APIC）。
为了开发能够阻断半胱氨酸组织蛋白酶活性的共价抑制剂，研究人员首先以cathepsin S（CTSS）的底物CD74序列的八聚肽LRMKLPKP为模板，在其N端添加了赖氨酸以用于未来的功能，并在C端用天冬氨酸替代脯氨酸，因为这能增强肽与CTSS的结合能力，后在四个不同的位置引入了Michael受体。通过荧光共振能量转移（FRET）试验测试了这些NNPIs对CTSS的抑制能力。结果表明，只有NNPI-3降低了蛋白酶活性，尽管效力较低。而且NNPI-3也能抑制CTSB和CTSK，但对H、Z和L没有活性。
他们构建了一个含有126个NNPIs的文库，通过位点饱和突变来优化NNPIs的抑制效果和特异性，发现替换位置5 的脯氨酸替换成缬氨酸，可以显著增强对CTSS的抑制作用，而取代位置2的亮氨酸为组氨酸或精氨酸，可以增强对CTSB的抑制作用，确定了NNPI-C10是最有效的CTSS抑制剂，NNPI-D5则是对CTSB高度特异的抑制剂，NNPI-F17为最佳的CTSK抑制剂，NNPI-G14为最佳的CTSKL抑制剂。但是产生最强抑制的组合并不是所有有希望的氨基酸变化都实现的组合，其影响不是纯粹叠加性的。
为了证明NNPI-C10与CTSS的共价结合，他们将荧光标记的NNPI-C10与CTSS蛋白孵育后进行凝胶电泳。在预期的蛋白分子量处成功出现了荧光条带，而后使用了一种半胱氨酸蛋白酶小分子抑制剂E64，它可以与NNPI-C10竞争CTSS蛋白的抑制靶点。先孵育NNPI-C10再孵育E64则不能使荧光条带消失，证明NNPI-C10的抑制是不可逆的共价结合。此外，用单键取代了Michael受体中的双键，发现这种改变消除了其共价阻断CTSS活性的能力。最后通过CTSS蛋白和NNPI-C10的晶体结构分析，证明了Michael受体与催化中心的C139形成共价键，但NNPI-C10在结合状态下没有采用完全扩展的构象，呈现了位置5和6的转弯构型。这种构象允许Michael受体到达活性半胱氨酸，并使NNPI-C10的7位色氨酸与酶催化袋边缘的疏水空腔之间相互作用。
为了克服膜通透性和体内半衰期等局限并特异性地将NNPI传递到肿瘤细胞，他们利用马来酰亚胺化学，设计了一系列抗体-肽抑制剂偶联物（即APIC）。通过质谱可观察到抗体与可变数量的NNPI偶联。结果显示，CTSS-APIC复合物在体外成功形成，与每个APIC结合的CTSS分子数量与结合的NNPI数量成比例地增加。
进一步将活化组氨酸标记的CTSS与APIC共孵育，并使用蛋白酶抑制剂E64作为对照来阻止其结合。Western blot分析证实了APIC - CTSS复合物的形成，在不同分子质量处存在多个特异性条带。通过流式细胞术测试了APIC的活性与抑制作用，首先使用了表达高水平CD22和CD79的淋巴瘤细胞和表达HER-2的乳腺癌细胞，将APIC与荧光基团AF488偶联，后使用猝灭剂在细胞表面阻断APIC荧光信号。在37℃维持的细胞中，大部分荧光信号被保留，而在4℃的细胞中，大多数与受体结合的APIC留在细胞表面，因此荧光信号被淬灭。为了测试溶酶体中APIC的积累，他们使用了仅在酸性环境中具有高荧光的pH敏感染料pHrodo，可以观察到生理状态下淋巴瘤和乳腺癌细胞的荧光信号与4°C相比特异性增加，这表明APIC内化后在溶酶体内积累。
接下来，他们使用探针BMV109来确定不同APIC在细胞中抑制其靶标的能力，同时使用其他小分子抑制剂作为对照。因BMV109探针只有在与组织蛋白酶反应后才会发出荧光，从而可以评估蛋白酶的活性。结果表明，预期分子质量处的荧光带消失，且qABP的荧光信号强度与给定组织蛋白酶的抑制作用成反比。
淋巴瘤细胞中CTSS的遗传KO诱导CD74的积累。因此，他们测试了APIC治疗是否可以重现在CTSS KO细胞中观察到的表型。用抗cd22 - c10处理的淋巴瘤细胞显示出CD74的剂量依赖性积累，超过了在高浓度petesicatib处理的细胞中检测到的水平。针对不同受体的低剂量APIC联合治疗诱导了CD74的积累，其水平与高剂量单个APIC治疗时的水平相似。在共培养实验中，APIC处理诱导CD8+ T细胞的强劲增殖和癌细胞的杀伤，CD8+ T细胞的激活只能在APIC治疗下实现，而不能用小分子CTSS抑制剂如petesicatib。最后，用APIC处理两种独立的乳腺癌细胞系(BT-474和HCC-1569)显示出细胞迁移显著减少，而抗her2抗体、NNPI-D5单独或抗her2和NNPI-D5的非偶联混合物没有诱导相同的效果。
为了评估APIC在体内的治疗潜力，他们使用临床前异种移植和转基因动物模型，对[64 Cu]-APIC进行了正电子发射断层扫描成像和生物分布研究。结果表明，注射后48小时，在肿瘤肿块中检测到[64 Cu]-APIC的特异性积累，但在其他器官中未检测到或在外周血中循环，且肿瘤的放射性信号减弱，未标记的APIC过量。接着，利用BMV109探针直接测量了淋巴瘤小鼠的组织蛋白酶活性，与未治疗的动物相比，APIC治疗的动物或CTSS KO肿瘤的荧光信号强度明显降低。
为了充分评估APIC治疗在体内的疗效，他们选择了VavP-Bcl2转基因动物，能自发发展为滤泡性淋巴瘤。用mAPIC治疗17天后的动物的B细胞和CD4+ T细胞显著减少，而CD8+ T细胞显著增加。运用多色免疫荧光组织分析和相对定量，可检测到APIC处理动物的B220+细胞和CD4+ T细胞减少，CD8+ T细胞增加。
综上所述，他们设计了共价抑制剂，并开发了一个快速鉴定的筛选平台，迅速提高了NNPI的效力、稳定性和内化，并实现了特异性。其抑制策略的发展为细胞类型特异性递送的新一代靶向治疗开辟了道路。
Petruzzella A, Bruand M, Santamaria-Martinez A, et al. Antibody-peptide conjugates deliver covalent inhibitors blocking oncogenic cathepsins[J]. Nat Chem Biol, 2024,20(9):1188-1198.DOI:10.1038/s41589-024-01627-z.
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