核法尼酯X受体通过稳定RUNX2促进成骨细胞分化防止骨质流失

首先，研究者对诱导成骨分化的 BMSC 进行了 RNA 测序分析（图 1a ）。结果显示， BMSC 成骨分化过程中，多个与成骨相关的基因显著上调，包括法尼酯 X 受体（ FXR ）（图 1b ）。体外诱导 BMSC 成骨分化，观察到成骨细胞标志基因 Runx2 、 Sp7 、 Alpl 、 Col1a1 及 FXR 的基因表达均随时间增加（图 1c-h ）。体内实验结果验证了上述发现（图 1i-k ）。

因 Prx1 基因仅在四肢和颌面部的间充质干细胞中表达，所以研究者通过杂交得到了 Prx1 ^cre ; FXR ^fl/fl 小鼠（图 2a ），并观察到新生 FXR ^Prx1 小鼠的头骨、锁骨和四肢的骨形成出现延迟（图 2b ， c ）。显微计算机断层成像（ micro-CT ）分析结果显示，与同龄对照组相比， FXR ^Prx1 小鼠骨体积分数（ BV/TV ）、骨密度（ BMD ）、皮质骨厚度（ Ct.TH ）、骨小梁数量（ Tb.N ）及骨小梁厚度（ Tb.Th ）均显著降低 , 骨小梁间距（ Tb.Sp ）增加（图 2d-j ）。细胞实验发现， FXR ^Prx1 小鼠 BMSC 成骨分化和钙化均受损（图 2m-p ）。

接着，研究者将 FXR ^fl/fl 小鼠与 Ctsk ^Cre 小鼠杂交，得到了破骨细胞特异性 FXR 敲除小鼠（图 3a ）。 WB 、免疫荧光染色、阿辛蓝及茜素红染色结果显示， FXR 在破骨细胞中被成功敲除，且 FXR ^Ctsk 新生小鼠的骨骼发育并无异常（图 3b ， c ）。此外，研究者发现 8 周龄的 FXR ^Ctsk 小鼠在 BV/TV 、 Tb.N 和 Tb.Sp 方面与同龄对照组小鼠无显著差异（图 3d-g ）。体外实验中， FXR 敲除并未影响多核破骨细胞的形成（图 3h ）。以上研究表明，破骨细胞中 FXR 的缺失并非骨骼畸形的主要原因。

接下来，研究者分析了 Runx2 、 Sp7 、 Alpl 和 Col1a1 等成骨相关基因的蛋白水平，发现 FXR 敲低后 RUNX2 和 SP7 的蛋白水平显著降低，且 FXR 敲除降低了成骨细胞中 RUNX2 的表达。双荧光素酶报告基因实验结果表明 FXR 敲低显著抑制了 OSE2- 荧光素酶和 6XRUNX2- 荧光素酶的激活。随后研究者使用了 FXR 抑制剂（ Z ） - 古树醇，发现其显著抑制了成骨相关基因表达；反之， FXR 的过表达则显著增强了这些基因的表达。免疫共沉淀实验实验结果发现 FXR 过表达显著降低了 RUNX2 的泛素化，敲低 FXR 则 RUNX2 泛素化水平升高。这些数据表明， FXR 可能通过减少其泛素化来促进 RUNX2 的稳定（图 4 ）。

接着，为了鉴定可能与 FXR 协同调节 RUNX2 泛素化的 E3 泛素连接酶，研究者采用免疫沉淀结合质谱分析来鉴定与 RUNX2 相互作用的蛋白。分析鉴定出 67 种在 FXR 敲除后与 RUNX2 结合增加的蛋白，且 Thoc6 在预测数据、 RNA 测序数据中均被选中（图 5b ），因此研究者继续探究 Thoc6 的功能。进一步实验发现，敲低 Thoc6 可显著增加 RUNX2 蛋白水平，而过表达 Thoc6 则显著降低 RUNX2 蛋白表达（图 5c,d ）。免疫沉淀结合质谱分析及 HDOCK 蛋白质对接算法生成 Thoc6 -RUNX2 复合物的三维结构模型等实验结果表明， Thoc6 通过与 RUNX2 的 N 端区域结合来抑制成骨细胞分化（图 5h-m ）。

进一步探索 FXR 对 Thoc6 表达的调控机制发现， FXR 敲除显著增加了 Thoc6 的表达， FXR 过表达则抑制 Thoc6 的表达（图 6a-d ）。免疫共沉淀实验结果发现， Thoc6 显著增加了 RUNX2 的泛素化水平，而 Thoc6 的敲低则降低了 RUNX2 的泛素化（图 6e ， f ）。通过对 Thoc6 启动子序列进行生物信息学分析，研究者发现了两个潜在的 FXR 结合位点，位于转录起始位点上游。随后的实验结果表明激活 FXR 可降低 Thoc6 的表达（图 6g-k ）。

最后，研究者建立了卵巢切除术诱导的骨质疏松症小鼠模型，并在卵巢切除术后用 OCA 处理小鼠。 Micro-CT 分析显示， OCA 处理的小鼠股骨中骨体积分数（ BV/TV ）、骨密度（ BMD ）、骨小梁数量（ Tb.N ）和骨小梁厚度（ Tb.Th ）增加，而骨小梁间距（ Tb.Sp ）减少。荧光标记矿化前沿的分析显示， OCA 处理的小鼠矿化沉积速率（ MAR ）和骨形成速率（ BFR ）增加。组织形态学分析进一步表明， OCA 处理减轻了卵巢切除术诱导的骨髓腔内脂肪细胞的积累。此外， OCA 处理的小鼠骨髓腔内成骨细胞系细胞数量增加，并且骨形成生物标志物 I 型前胶原 N 端前肽水平也增加。这些结果表明，药理激活 FXR 可促进体外和体内的成骨细胞分化，并且 FXR 可作为治疗骨质疏松症的潜在治疗靶点（图 7 ）。

综上所述，本研究发现 FXR 是成骨作用的正向调节因子，影响骨发育和成骨细胞分化。 FXR 通过抑制 Thoc6 的表达来抑制 Thoc6 介导的 RUNX2 泛素化，从而稳定 RUNX2 并对抗依赖泛素的蛋白酶体降解。这些发现共同表明，靶向 FXR 是一种治疗骨质疏松症的有前景的治疗策略。

本研究由河北医科大学第三医院的侯志勇教授团队完成，并于 2025 年 1 月 30 日在线发表于 Bone Research 。

论文信息： Dong Q, Fu H, Li W, Ji X, Yin Y, Zhang Y, Zhu Y, Li G, Jia H, Zhang H, Wang H, Hu J, Wang G, Wu Z, Zhang Y, Xu S * , Hou Z * . Nuclear farnesoid X receptor protects against bone loss by driving osteoblast differentiation through stabilizing RUNX2. Bone Res 2025,13(1):20.

供稿：曹天宇

审校：孙亨

编辑：霍娅娅