国自然申请中的加分技术，研究细胞表型转换和细胞命运决定，用上它这不就高端了么？！

小张聊科研 · 公众号 · 科研 · 2025-01-07 21:00

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先前我们梳理了国自然申请中最常见的 7 类细胞表型转换（ 国自然申请 | 最常用的 7 类细胞表型转换，特点和指标都总结好了！ ），也介绍过肿瘤转移研究中的一个新主题——贴壁 - 悬浮态转换 AST （ 做肿瘤转移只知道上皮 - 间质转分化 EMT ？ AST 了解一下？！ ），当然还给大家推荐过一个肿瘤和非肿瘤研究都可以关注的一个方向—— 谱系可塑性（ Lineage plasticity ） （ 肿瘤、非肿瘤研究哪个热点好？想了一下还是推荐这个给大家…… ），今天我们介绍的技术就可以用来研究上面这些技术—— 谱系示踪（ Lineage tracing ） 。

谱系示踪 是一种用于研究细胞发育和分化过程的技术， 通过标记特定的细胞群体并追踪其后代的命运，帮助揭示细胞的起源和分化路径 。谱系示踪在发育生物学、干细胞研究和疾病模型等领域具有重要应用。

谱系示踪的原理主要基于 基因重组系统，如 Cre-loxP 系统。该系统通过在特定细胞中激活 Cre 重组酶，识别并切割 loxP 位点之间的 DNA 片段，从而永久标记这些细胞及其后代 。 常用的方法包括使用荧光报告基因，如 GFP 或 RFP ，来标记细胞，使其在显微镜下可以被观察和追踪。 此外，为了提高标记的特异性和准确性，近年来开发了 双重组酶系统，如 DeaLT 技术，结合 Dre-rox 和 Cre-loxP 系统，通过在可能引起 Cre 异位表达的细胞中切除 loxP 位点，避免非特异性重组。

下面我们通过几个案例看一下谱系示踪在研究中的应用：

本研究揭示了 Sfrp1 在成纤维细胞向肌成纤维细胞转变过程中抑制其侵袭的作用 。研究发现在肺损伤后， 成纤维细胞进入一种高表达 Sfrp1 的过渡状态，这一状态最初是非侵袭性的； TGF β 1 能够下调 SFRP1 ，促使这些细胞转变为侵袭性的 CTHRC1+ 肌成纤维细胞。 在这项研究中， 谱系示踪技术用于追踪成纤维细胞在肺损伤后的命运变化：通过 Tcf21-Cre 报告小鼠模型，研究人员标记了成纤维细胞，并观察其在损伤后的分化路径。结合单细胞 RNA 测序，研究人员能够识别出成纤维细胞在损伤后早期的过渡状态，并追踪其向肌成纤维细胞的转变过程。

研究发现， 在非酒精性脂肪性肝炎（ NASH ）模型小鼠中，肝星状细胞（ HSCs ）在损伤后会经历一种向间皮细胞（ MCs ）的发育前体状态的逆转过程，这一过程中形成的损伤相关中间体（ DIHMs ）高度表达炎症和纤维化相关基因。通过 Cre 和 Dre 诱导的 DIHMs 耗竭可以减少肝纤维化和缓解 NASH 模型小鼠的肝损伤。此外，敲低 Osr1 可以阻止 DIHMs 的诱导，从而减少肝纤维化。 研究中 使用了双重组酶系统进行谱系示踪，通过标记 Pdgfrb+ 的肝星状细胞中的 Krt19 表达细胞，追踪了肝星状细胞向间皮细胞状态逆转的过程。这种方法能够详细观察细胞在损伤后的命运变化，揭示了在肝纤维化过程中，肝星状细胞如何通过一种中间状态（ DIHMs ）向间皮细胞状态转变 。

本研究揭示了 Zeb1 在神经内分泌前列腺癌（ NEPC ）发展中的关键作用 。 前列腺癌细胞在 Zeb1 的调控下，经历一个中间状态，表现出上皮 - 间充质转化（ EMT ）、干细胞特性和神经内分泌特征。 Zeb1 通过转录调控关键糖酵解酶的表达，使肿瘤细胞倾向于利用糖酵解进行能量代谢，导致乳酸积累，进而通过组蛋白乳酸化增强染色质可及性和细胞可塑性，促进 NEPC 的发展。 在这项研究中， 谱系示踪技术用于追踪前列腺癌细胞在向 NEPC 转变过程中的命运变化。通过标记 Zeb1+ 的上皮样细胞，研究人员能够观察这些细胞如何在体内分化并形成 NEPC 。这种方法帮助确定了 Zeb1+ 细胞作为 NEPC 的潜在起源细胞，并揭示了其在肿瘤进展中的关键作用。

本研究发现， 膜蛋白 Itm2a 是标记骨膜周围骨骼干细胞（ P-SSCs ）的标志物 。 通过单细胞转录组学，研究人员发现 Itm2a 在 P-SSCs 中富集，这些细胞具有克隆多能性和自我更新能力，并位于其分化层次的顶端。 Bmp2 缺失或 Itm2a+P-SSCs 的缺失会导致骨折愈合缺陷，表明这些细胞在骨折愈合中起关键作用。研究还发现， ITM2A+P-SSCs 也存在于人类骨膜中，为骨骼疾病的药物和细胞治疗提供了潜在靶点。 在这项研究中， 谱系示踪技术用于追踪 Itm2a+ P-SSCs 在骨折愈合过程中的命运和分化路径。研究人员使用双重组酶系统进行遗传谱系示踪，标记 Itm2a 和 Prrx1 谱系的细胞，观察它们在愈合过程中生成的软骨细胞和成骨细胞的空间分布。

本研究揭示了 ALKBH5 在小鼠心脏纤维化中的关键作用 。研究发现， 在血管紧张素 II 诱导的高血压条件下，心脏巨噬细胞倾向于向肌成纤维细胞转变（ MMT ），这一过程伴随着 ALKBH5 表达的增加。 ALKBH5 通过调控 IL-11 mRNA 的 m6A 去甲基化，增加 IL-11 mRNA 的稳定性和蛋白水平，从而促进 MMT 和心脏纤维化。巨噬细胞特异性敲除 ALKBH5 可以抑制 Ang II 诱导的 MMT ，改善心脏纤维化和功能障碍。此外，通过靶向递送 ALKBH5 或 IL-11 受体α (IL11RA1) siRNA 至单核细胞 / 巨噬细胞，可以减轻高血压下的 MMT 和心脏纤维化。 在这项研究中，谱系示踪技术用于追踪心脏巨噬细胞在高血压条件下的命运变化。通过标记循环单核细胞来源的心脏巨噬细胞，研究人员观察到这些细胞在高血压条件下优先向肌成纤维细胞转变。

本研究揭示了 磷酸二酯酶 4B （ PDE4B ）在肺动脉高压（ PH ）中的关键作用 。研究发现， PDE4B 是肺中主要的 PDE 同工酶，其在 PH 肺组织中表达上调。 PDE4B 主要在肺内皮细胞中表达，并通过驱动内皮 - 间质转化（ EndMT ）促进 PH 的发展。具体机制上， PDE4B 通过拮抗 cAMP 依赖的 PKA-CREB-BMPRII 信号轴来调节 EndMT 。使用 PDE4B 特异性抑制剂治疗 PH 大鼠，显著改善了 PH 症状。 在这项研究中， 谱系示踪技术用于追踪肺内皮细胞在PH发展中的命运变化。通过标记肺内皮细胞 ，研究人员观察到 PDE4B 在内皮细胞中的表达如何驱动这些细胞向间质细胞的转化。

最后，我们选 PDE4B 这篇文章看一下谱系示踪的实验方法：

动物模型 ：使用 C57BL/6 J 小鼠进行实验。通过 CRISPR/Cas9 技术生成 Pde4b 基因敲除（ Pde4bKO ）小鼠，以及 Pde4b 基因特异性在内皮细胞中敲除的小鼠（ Pde4bEC−/− ）。

谱系示踪模型： 通过将 Tek-Cre 小鼠与 mTomato/mGFP-ﬂoxed 双荧光 Cre 报告小鼠（ mTmG 小鼠）交配，生成具有内皮细胞谱系标记的小鼠。这些小鼠在内皮细胞中表达 Cre 重组酶，能够激活 mGFP 报告基因，从而标记内皮细胞及其后代。

实验步骤

1. 动物处理： 将小鼠随机分为不同的实验组，包括正常对照组和诱导 PH 的实验组。使用 SU5416/hypoxia （ SuHx ）诱导 PH 模型。

2. 谱系示踪标记： 在实验开始前，通过 Cre 重组酶激活 mGFP 报告基因，标记内皮细胞及其后代。 mGFP 的表达使得研究人员能够在显微镜下观察和追踪这些细胞的命运变化。

3. 组织收集与分析： 在实验结束时，收集小鼠的肺组织。对肺组织进行固定和切片，进行免疫荧光染色，检测 mGFP 和间质细胞标志物α -SMA 的共定位。通过观察 mGFP 和α -SMA 双阳性细胞的数量和分布，评估内皮细胞向间质细胞的转化程度。

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