Plus深读 | 利用cfDNA分析人类心肌细胞死亡

1：寻找到心肌细胞中的DNA甲基化标记物：未甲基化的FAM101A

首先研究者通过DNA甲基化测序手段，分析了心腔（包括心房和心室）以及其他23个组织中的甲基化差异，发现FAM101A序列上存在不同于其他组织的未被甲基化的胞嘧啶；通过亚硫酸盐处理后测序也证明了这一结果（Fig.1a-c）。将心肌DNA和其他组织DNA混合后，仍旧能够检出即使是0.1%的心肌DNA也能够检出（Fig.1d-e）。

因此，接下来的研究中将未甲基化的FAM101A作为心脏特异cfDNA的标记。

Figure 1

2：cfDNA (cell-free, circulating DNA)测序区分健康和疾病人群

分别测序STEMI（急性心肌梗死）病人和健康人群cfDNA，未甲基化的FAM101A作为心脏cfDNA水平，发现STEMI病人体内cfDNA水平远高于常人（Fig.2a-d）。联合分析肌钙蛋白Troponin和cfDNA水平，发现二者正相关，即FAM101A水平高的病人体内同样有较高的Troponin（Fig.2e-f）。与此同时total的cfDNA水平并没有明显的相关性。这暗示着，心脏特异cfDNA一定程度上能够代表心脏损伤的程度。

STEMI病人接受冠状动脉重建术（Coronary revascularization）后，会出现心脏标记的突然上升（Fig.3a-b），与此同时troponin水平也会随之上升（Fig.3a-b）；在术后1-2天内，又会逐渐下降（Fig.3c）。

Figure 2

Figure 3

3：败血症患者存在心脏损伤，并且会影响其生存

临床上患有败血症的病人常常伴有troponin水平上升，因此研究者利用本研究方法分析了患者的心脏损伤程度。如图4a-b所示，有相当一部分败血症患者体内未甲基化FAM101A水平升高，意味着存在心脏损伤；并且这部分心脏特异cfDNA高的病人，存活显著差于低的病人（Fig.4c）。

Figure 4

4：利用ddPCR方法，探测CpG甲基化水平

接下来，研究者在FAM101A上游5个CpG上分别设计2对probe（1和2），通过digital droplet PCR (ddPCR)的方法能够将心肌细胞和造血系细胞区分开(Fig.5a)，并且两个probes同时使用会有更好的区分效果（Fig.5b-c）。

进一步将这个ddPCR的体系应用在STEMI病人和正常人群检测中，发现能够清晰的区分这两个组别（Fig.5d）。

Figure 5

Zemmour H, et al. Bisulfite genomic sequencing: systematic investigation of critical experimental parameters. Nat Commun. 2018 Apr 24;9(1):1443.