重磅 | 解码大脑迈出一大步？北京大学成功研制新一代微型化双光子荧光显微镜

什么是微型化双光子荧光显微镜？

成像技术是推动生命科学进步的核心动力。上世纪以来，人类陆续发现了包括 X 射线、全息照相法、CT、电子显微镜、MRI 磁共振成像、超高分辨率显微成像在内的多种成像技术。

而近年来，生命科学研究的发展趋势从分子与细胞的层级上升到离体组织与器官、历经在体麻醉动物细胞显微到现在的清醒动物的分子与细胞动态信号，不断对成像技术提出新的要求，即在清醒活体的状态下还要保证分子水平的分辨率。 

主导本次研发过程的程和平院士团队认为，双光子显微成像会是解决这个挑战的一个重要方面。

程和平院士（雷锋网 现场拍摄）

据程院士介绍，双光子显微镜其实不是新鲜事物，1930 年代，M·Goeppert Mayer 就提出了双光子吸收跃迁的基本原理；1960 年代，激光器的发明使得双光子效应被验证和应用；1990 年，Denk，Webb 发明了第一台双光子显微镜，至今已有 20 多年的历史。

如今，双光子荧光显微镜是活体动物神经成像的经典方法。双光子成像本身具有高分辨率、高通量 (高速)、非侵入、成像深度大等特点，与荧光蛋白以及荧光染料等标记物在细胞中的定位与表达技术相结合，能够在生命体和细胞仍具有活性的状态下对其功能进行动态观察，使得人们可以研究处于生理状态时的动物大脑内的神经元活动。^[1]

双光子成像技术面临的挑战

程院士认为，尽管双光子成像有看得准、看得深、光损伤小等优点，但也存在看活体不准、扫描速度慢、体积庞大无法便携化等缺点。

之前在神经科学领域，如果科学家想要对小动物在行为过程中的大脑活动进行成像研究，是采用了一种看起来非常好玩而又黑科技的方式。将虚拟现实与双光子成像相结合，在小动物头部被固定的情况下，在其眼前制造影像，让动物认为自己处在 “真实” 的环境之中，通过动物四肢在类似跑步机或者鼠标滚球上的运动来模拟其真实活动，以求达到研究神经元在动物行为中所起到的作用。^[1]

但是，这种虚拟现实加头部固定成像的方法，已经遭到许多科学家的质疑。他们认为，头部被固定会使动物在实验期间受到物理约束和情绪的压力，因此无法证明虚拟现实下得到的结果等同于真实环境。更重要的是，许多社会行为，比如亲子护理，交配和战斗，是不能用头部固定的方式进行研究的。如何在动物自由活动的时候，直接对其神经元进行成像，是神经科学家还未能得到解决终极的诉求。^[1]

所以，开发一种微型荧光显微镜，让其直接固定在自由活动的动物身上成为了解决问题的关键。十多年来，人们经历了微型单光子宽场显微镜；重达 25 克、且成像速度慢的双光子显微镜等阶段，一直无法攻克微型双光子显微镜需要解决的诸多技术难题。

新一代微型化双光子荧光显微镜的性能

在这样的背景下，北京大学联合解放军军事医学科学院组成了跨学科团队，历经三年时间，成功研制出新一代高速高分辨微型化双光子荧光显微镜，并获取了小鼠在自由行为过程中大脑神经元和神经突触活动清晰、稳定的图像。原始论文于 5 月 29 日在线发表于自然杂志子刊 Nature Methods 上。

据悉，新一代微型化双光子荧光显微镜重量仅 2.2 克，横向分辨率可达到 0.65 微米，成像质量与商品化大型台式双光子荧光显微镜可相媲美。采用双轴对称高速微机电系统转镜扫描技术，成像帧频已达 40HZ（256*256 像素），同时具备多区域随机扫描和每秒 1 万线的线扫描能力。

此外，采用自主设计可传导 920nm 飞秒激光的光子晶体光纤，该系统首次实现了微型双光子显微镜对脑科学领域最广泛应用的指示神经元活动的荧光探针（如 GCaMP6）的有效利用。同时采用柔性光纤束进行荧光信号的接收，解决了动物的活动和行为由于荧光传输光缆拖拽而受到干扰的难题。未来，与光遗传学技术的结合，有望在结构与功能成像的同时，精准地操控神经元和神经回路的活动。

研究意义和价值

微型化双光子荧光显微成像改变了在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式，可用于在动物觅食、哺乳、跳台、打斗、嬉戏、睡眠等自然行为条件下，或者在学习前、学习中和学习后，长时程观察神经突触、神经元、神经网络、远程连接的脑区等多尺度、多层次动态变化。

该成果在 2016 年底美国神经科学年会、2017 年 5 月冷泉港亚洲脑科学专题会议上报告后，得到包括多位诺贝尔奖获得者在内的国内外神经科学家的高度赞誉。

冷泉港亚洲脑科学专题会议主席、美国著名神经科学家加州大学洛杉矶分校的 Alcino J Silva 教授在评述中写道

从任何一个标准来看，这款显微镜都代表了一项重大技术发明，必将改变我们在自由活动动物中观察细胞和亚细胞结构的方式。它所开启的大门，甚至超越了神经元和树突成像。系统神经生物学正在进入一个新的时代，即通过对细胞群体中可辨识的细胞和亚细胞结构的复杂生物学事件进行成像观测，从而更加深刻地理解进化所造就的大脑环路实现复杂行为的核心工程学原理。毫无疑问，这项非凡的发明让我们向着这一目标迈进了一步。

目前脑科学的发展如火如荼，各国脑科学计划的一个核心方向就是打造用于全景式解析脑连接图谱和功能动态图谱的研究工具。其中，如何打破尺度壁垒，整合微观神经元和神经突触活动与大脑整体的活动和个体行为信息，是领域内亟待解决的一个关键挑战。

该设备的成功问世对于脑科学的研究有重大意义，人类探索大脑星辰大海的征程又进入一个崭新的阶段。

程和平院士团队接受采访（雷锋网 现场拍摄）

研究团队接受采访

主题演讲结束后，程和平院士团队接受了雷锋网等媒体的采访，以下是采访实录，雷锋网 (公众号：雷锋网) 做了不改变原意的整理：

1、提到脑科学，不得不让人联想到现在很火热的人工智能。请问目前你们团队所取得的成绩可以和人工智能的哪方面研究做对接？

程院士团队：目前的人工智能还处于弱人工智能阶段，要想实现强人工智能，还是要像生物脑进行学习。最简单的一个模式生物，学会一件事情或者说一个条件学习的过程，只需要半个小时或一个小时就能形成。在这个过程中神经的回路正在发生了什么变化，原来是没办法知道的，但是用了我们这些微型化的镜子，就可以在它们执行某个动作的学习的过程中看到各个回路不同层次的特性变化。

2、现在的显微镜技术和你们新研究出来的技术有何区别？新研究的先进性体现在哪里？

程院士团队：我们的竞争对手是 Mark Schnitzer 教授，他是美国脑计划的发起人，所以我们刚开始也是征询了他们的意见的。我们和他们最大的不同是在同样重量的情况下，我们的分辨率更高、而且看的更深。

3、这个研究成果在人类大脑的应用前景如何？

程院士团队：比如，在外科手术的临床应用上，因为我们可以提供手持式的技术，当需要做开颅手术的时候，就可以看到肿瘤的边界和大脑的神经活动。

4、这项研究的商业化进展如何？

程院士团队：目前已经有两个诺贝尔奖获得者对我们的研究感兴趣，想一起合作。说明这个技术还是很受欢迎的。就像刚才说的，一方面能够将技术封装为手持式或内窥的医用设备，一方面神经科学家需要的那种显微镜，一只研究的小鼠头上就要带一台，如果是猴子的话可能要带几台，所以我们认为市场还是非常大的。

参考资料：

1、微型双光子荧光显微镜   Dr. 宗伟健