骨关节炎（OA）是以软骨退化、滑膜炎症和骨赘形成为特征的慢性退行性关节疾病。滑膜巨噬细胞在OA的滑膜区尤其丰富且具有显著的可塑性，可根据不同的局部微环境分化为M1或M2表型以参与OA进展。M1型滑膜巨噬细胞通过加重炎症反应和氧化应激，直接损伤软骨组织或诱导软骨细胞凋亡。相反，M2型巨噬细胞通过产生抗炎细胞因子来缓解炎症并促进组织修复。因此，如何实现巨噬细胞表型极化和抗氧化的重编程是治疗OA的关键策略。
线粒体自噬功能障碍的巨噬细胞无法清除受损的线粒体，导致大量活性氧的积累，维持巨噬细胞M1表型的持续存在。采用槲皮素（Que）靶向滑膜巨噬细胞，促进线粒体自噬来恢复线粒体功能稳态是一种调控巨噬细胞行为的可行性策略，但其存在水溶性差、半衰期短、药效不持久、生物利用度低等问题。另一方面，OA患者关节部位对氧气的过度消耗会迫使巨噬细胞在适应乏氧微环境时优先使用糖酵解代谢途径，这也是驱动巨噬细胞向M1表型极化的重要原因，因此缓解乏氧来调控巨噬细胞表型同样具有应用潜力。过氧化氢酶（CAT）可以通过直接催化M1巨噬细胞中过度积累的过氧化氢转为氧气来补充炎症部位对氧气的消耗，然而酶作为一种蛋白类大分子，存在细胞膜渗透性差、易被降解、体内生物利用度较低等亟待解决的问题。
纳米技术的发展为解决酶和化疗药物递送问题提供了重要的解决方案。具有精确分子量分布和三维刚性结构的含磷树状或树冠大分子已发展成为药物或蛋白质的载体。重要的是，以羟基或亚磷酸钠末端的含磷树状大分子由于其固有的免疫调节活性，既可以作为递送载体，也可以作为治疗药物。因此，构建基于含磷树状大分子的纳米平台有望将线粒体自噬诱导剂与缓解乏氧的天然酶进行有机结合，提升药物和酶的生物利用度，用于重编程巨噬细胞进而调控成骨免疫微环境实现骨关节炎的综合治疗。
为了解决以上问题，东华大学沈明武研究员/史向阳教授团队与法国国家科学研究中心Jean-Pierre Majoral院士团队合作构建了一种基于羟基化含磷树状大分子（G2-OH24）的CAT和Que共递送纳米系统（图1）。所制备的共递送系统G2-OH24/CAT@Que具有良好的胶体稳定性和催化活性，能够通过缓解细胞内乏氧和恢复线粒体功能来实现巨噬细胞的M2抗炎极化和抗氧化的重编程。这种共递送系统介导的免疫调节效应有效抑制软骨细胞凋亡并促进骨髓间充质干细胞（BMSCs）的成骨分化，实现OA的抗炎/抗氧化/软骨保护/骨修复综合治疗。
图1. G2-OH24/CAT@Que的制备和治疗机制示意图。TEM图像显示所制备的G2-OH24/CAT和G2-OH24/CAT@Que的形貌为均匀分散的球形结构，尺寸大小分别为119.7 nm和138.8 nm （图2A-B）。此外，表面电势、UV-Vis图谱以及SDS-PAGE图谱进一步证明了CAT和Que在G2-OH24/CAT@Que复合物中的成功负载 (图2C-E)。重要的是，所制备的G2-OH24/CAT@Que不仅可以有效维持CAT酶活性还增强了其在蛋白酶存在下的稳定性，具有浓度依赖性的氧气产生能力（图2G-I）。
图2.（A）G2-OH24/CAT和（B）G2-OH24/CAT@Que的水合粒径分布图和TEM图像；不同材料的（C）表面电势、（D）UV-Vis图谱和（E）SDS-PAGE图谱；（F）G2-OH24/CAT@Que在不同分散体系中一周内的水合粒径尺寸变化；（G）不同材料的酶活性；（H）G2-OH24/CAT@Que与蛋白酶K孵育不同时间后的相对酶活力；（I）不同浓度下G2-OH24/CAT@Que的氧气产生能力。在图C、E和G中，Ⅰ是CAT；Ⅱ是G2-OH24/CAT；Ⅲ是G2-OH24/CAT@Que。研究团队发现G2-OH24/CAT@Que以时间依赖性的方式促进CAT的胞内递送（图3A-C），并且纳米复合物主要是通过网格蛋白和脂阀介导的内吞途径进入细胞（图3D）。由于G2-OH24/CAT@Que具有良好的CAT活性，可以催化细胞内过氧化氢转化为氧气，从而保护细胞免受过氧化氢诱导的死亡（图3E）并补充细胞内的氧气水平（图3F-G）。细胞内氧气水平的升高可以抑制缺氧诱导因子（HIF-1α）以及糖酵解相关标志蛋白的表达（图3H），有利于巨噬细胞从M1表型向抗炎M2表型的极化。
图3.（A-B）G2-OH24/CAT@Que促进CAT细胞内递送的流式定量图和CLSM图像；（C）RAW264.7细胞与G2-OH24/CAT@Que共孵育不同时间后细胞内荧光强度的流式细胞图；（D）不同内吞抑制剂预处理的细胞与G2-OH24/CAT@Que培养后细胞内荧光强度的流式定量结果；（E）不同材料预处理的细胞与过氧化氢共孵育24小时后的细胞活力；（F-G）不同材料处理后的RAW264.7细胞中氧气水平变化的流式定量结果和CLSM图像；（H）WB分析不同材料处理后细胞中相关标志蛋白的表达水平。在图G中：Ⅰ是PBS；Ⅱ是CAT；Ⅲ是G2-OH24/BSA；Ⅳ是Que；Ⅴ是G2-OH24/CAT；Ⅵ是G2-OH24/CAT@Que。
研究团队发现G2-OH24/CAT@Que的处理可以有效抑制自噬标志蛋白p-62的表达（图4A），这得益于共递送系统中Que的包封。另外，线粒体自噬的有效启动可帮助巨噬细胞清除功能失常的线粒体，从而使得线粒体膜电位正常化（图4B-D）。与此同时，G2-OH24/CAT@Que还可以清除LPS激活产生的大量活性氧，展现出良好的氧化应激缓解能力（图4E）。因此，G2-OH24/CAT@Que的线粒体自噬功能和活性氧清除能力的协同有望实现线粒体稳态的恢复。
图4.（A）WB检测不同处理后细胞内p-62的表达水平；不同处理后RAW264.7细胞内线粒体膜电位变化的（B）CLSM图像和（C-D）流式细胞术定量结果；（E）CLSM观察不同材料处理后细胞内活性氧的荧光强度。在图A和B中，Ⅰ是PBS；Ⅱ是LPS；Ⅲ是CAT；Ⅳ是G2-OH24/BSA；Ⅴ是Que；Ⅵ是G2-OH24/CAT；Ⅶ是G2-OH24/CAT@Que。由于G2-OH24/CAT@Que表现出优异的细胞内氧气产生和线粒体功能恢复性能，研究团队分析了G2-OH24/CAT@Que对巨噬细胞表型的调节作用。流式细胞术和免疫荧光染色结果显示，G2-OH24/CAT@Que处理可以有效的抑制M1型标志物CD86的表达并升高M2型巨噬细胞标志物CD206和CD163的表达，具有杰出的巨噬细胞表型调节能力（图5A-B）。同时，该共递送系统在调节促炎或抗炎细胞因子分泌的能力也优于其他处理组（图5D-E）。重要的是，由于共递送系统处理的巨噬细胞可分泌大量的生长因子和抗炎因子，其来源的条件培养基有助于抑制软骨细胞的凋亡（图5F）并促进BMSCs的成骨分化（图5G-H）。
图5.（A）不同材料处理后巨噬细胞极化的流式细胞图；（B）不同材料处理后细胞中CD86和CD163表达的免疫荧光染色结果图；（C）条件培养基的提取和培养示意图；（D-E）检测不同材料处理后细胞上清液中的TNF-α和IL-10的表达水平。（F）不同条件培养基处理后软骨细胞的凋亡和坏死情况；（G）不同条件培养基处理后BMSCs中OCN mRNA的表达水平；（H）不同条件培养基处理后BMSCs的ALP和茜素红染色结果。在图H中，Ⅰ是PBS；Ⅱ是LPS；Ⅲ是CAT；Ⅳ是G2-OH24/BSA；Ⅴ是Que；Ⅵ是G2-OH24/CAT；Ⅶ是G2-OH24/CAT@Que。研究团队通过构建小鼠OA模型验证共递送系统的体内治疗效果（图6A）。在图6B-E中，番红-O-固绿和Mmp-13染色结果显示共递送系统G2-OH24/CAT@Que治疗后可以抑制软骨组织降解，表现为软骨层增厚、番红-O-固绿染色均匀、OARSI评分降低、基质金属蛋白酶Mmp-13的表达降低，其治疗效果优于单药组分混合治疗组（G2-OH24+CAT+Que）。另外，OA小鼠的炎性膝关节的Micro-CT结果显示，共递送系统治疗组的软骨和骨侵蚀程度明显得到改善，软骨表面完整光滑，结构恢复至正常小鼠水平（图6F）。Micro-CT的定量结果进一步支持了这一发现（图6G-I）。总的来说，这种集缓解乏氧和恢复线粒体功能为一体的多功能纳米制剂可以通过巨噬细胞重编程成功实现在OA小鼠模型中的综合治疗。
图6.（A）OA小鼠模型的体内治疗方案；（B-C）不同治疗后小鼠炎症膝关节的番红-O-固绿染色和OARSI评分结果。（D-E）不同治疗后小鼠炎症膝关节的Mmp-13免疫荧光切片染色和相对荧光强度；（F-I）不同治疗后小鼠炎症膝关节的Micro-CT成像图以及BMD、BV/TV、Tb.Th定量结果。
受G2-OH24/CAT@Que在体内外强大抗炎活性的启发，研究团队从OA患者的关节腔积液中提取了贴壁黏附单核细胞（AEMs），并通过流式细胞术分析G2-OH24/CAT@Que和临床一线药物双氯芬酸（DS）对AEMs中巨噬细胞表型和活性氧水平的影响（图7A）。结果显示，G2-OH24/CAT@Que更显著的诱导了AEMs中巨噬细胞向M2表型极化（图7B-C）。尽管DS在一定程度也发挥了巨噬细胞表型极化能力，但其降低AEMs中活性氧的能力远低于所制备的G2-OH24/CAT@Que（图7D），表明共递送系统G2-OH24/CAT@Que在临床应用中的潜力。
图7.（A）AEMs的提取分离示意图；（B-C）不同材料处理后AEMs中巨噬细胞极化的流式细胞结果；（D）不同材料处理后AEMs中活性氧水平的流式细胞术定量结果。简而言之，该研究设计的基于羟基化含磷树状大分子的蛋白质/药物共递送平台具有多个优势：1）提高CAT和Que的生物利用度，实现功能药物的细胞内共递送；2）通过缓解缺氧和恢复线粒体稳态，实现巨噬细胞向M2抗炎表型极化和抗氧化的重编程；3）利用巨噬细胞重编程产生的免疫效应来重塑骨免疫微环境，促进BMSCs成骨分化并抑制软骨细胞凋亡，实现OA的综合治疗。本研究提出了一种基于含磷树状大分子纳米药物的共递送系统，通过发挥树状大分子、药物和蛋白质的全活性成分的优势，可有效治疗OA或其他炎症性疾病。以上研究成果以“Bioactive phosphorus dendrimers deliver protein/drug to tackle osteoarthritis via cooperative macrophage reprogramming”为题，在线发表于国际著名期刊Biomaterials (DOI: 10.1016/j.biomaterials.2024.122999)。东华大学生物与医学工程学院沈明武研究员和史向阳教授为共同通讯作者，东华大学博士生孙虎啸为第一作者。该工作得到了国家重点研发计划项目、国家自然科学基金项目、上海市科委项目、中国-中东欧国家联合教育项目、中央高校基本科研业务费专项资金-东华大学研究生创新基金资助等项目的资助。
文章链接：
https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2024.122999
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