2023
年
4
月，
军事医学科学院
王升启
团队
的
研究人员
在
Signal Transduction and Targeted Therapy
上发表题为
《
Monkeypox virus quadrivalent mRNA vaccine induces immune response and protects against vaccinia virus
》
的文章。基于猴痘病毒的四种特异性蛋白（
A29L
、
M1R
、
A35R
、
B6R
）
和脂质纳米颗粒（
Lipid nanoparticle
，
LNP
）封装的
mRNA
平台，研究人员开发
了两种四价
mRNA
猴痘疫苗，
可
诱导小鼠产生
MPXV
特异性
IgG
抗体
和强效痘苗病毒
（
Vaccinia virus
，
VACV
）
特异
性中和抗体
，并激发
MPXV
特异性
Th-1
偏向细胞
免疫
和持久的效应记忆
T
和生发中心
B
细胞反应
，
两种疫苗可
保护小鼠免受
VACV
攻击
。今天，
菌菌将
详细解读这篇文献。
发表期刊
:
Signal Transduction and Targeted Therapy
发表时间
:
2023
年
4
月
影响因子
:
40.8
应用技术
:
NxGen
微流控技术、透射电镜、转录组、慢病毒转染、免疫印迹、、
Quant-it RiboGreen RNA
定量、流式细胞术、
ELISA
、
ELISPOT
、生物发光成像（
BLI
）、
H&E
染色等。
正痘病毒（
O
rthopoxvirus
）是一类双链
DNA
病毒，包括天花病毒
（
Variola
Virus
，
VARV
）
、
VACV
、
MPXV
和牛痘病毒
（
Cowpox
virus
，
CPXV
），可产生
2
种
抗原组成不同的
具有感染性的病毒粒子，一种是
细
胞内成熟病毒
粒子（
I
ntracellular mature virus
，
IMV
）
，如
M1R
、
E8L
、
A29L
等
。另
一种是
细
胞外包膜
病毒
粒子
（
E
xtracellular enveloped virus
，
EEV
）
，
EEV
在
I
MV
的基础上多了一层来自内质网的包膜，这层包膜上面嵌入了特异性的蛋白，如
A35R
、
B6R
等。本研究选择猴痘病毒的同源基因
（
非痘苗病毒
）
，靶向
MPXV
的四种抗原：
A29L
和
M1R
（
IMV
特异性蛋白），
A35R
和
B6R
（
EEV
特异性蛋白）
，
开发了两种猴痘四价
mRNA
疫苗
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
，
两种
疫苗能够诱导
小鼠产生
特异性
IgG
抗体
和抗
VACV
中和抗体，
免疫小鼠产生了持久的细胞免疫反应，
且
疫苗能够保护小鼠免受
VAVC
攻击
。
该项研究中，研究人员选择
A29L
、
A35R
、
M1R
和
B6R
作为
mRNA
编码序列的抗原靶点，开发了针对
IMV
和
EEV
的
MPXV
四价
mRNA
疫苗，修饰后的
mRNA
分子包含
5’
Cap
、
5’ UTR
、编码抗原的开放阅读框、
3’ UTR
和
Poly-A
尾（图
1a
）。基于不同的
mRNA
设计平台，
研究人员
构建了两组
mRNA
疫苗
：
mRNA-A-mix
和
mRNA-B-mix
。
Western blot
分析发现，
mRNA-mix
在对应四种抗原蛋白的位置上均检测到条带，表明
mRNA-A-mix
和
mRNA-B-mix
成功表达蛋白（图
1b
）。
LNP
制备过程中，作者
首先将
阳
离子脂质、
1
，
2-
二硬脂酰
-sn-
甘油
-3-
磷酸胆碱（
DSPC
）、胆固醇和
DMG-PEG2000
按摩尔比
50
：
10
：
38.5
：
1.5
溶解在乙醇
中
，再使用基于
NxGen
微流体技术的
Nano Assemblr Ignite™
系统，将脂质混合物与含有
mRNA
的
20 mM
柠檬酸缓冲液（
pH 4.0
）以
1:3
的体积比混合，以实现
mRNA
的
包封。
最后使用
100K MWCO
蛋白浓缩管
(PES)
浓缩至所需浓度，得到两种四价
mRNA
-LNP
分别命名为
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
（图
1c
）。使用
Litesizer
TM
500
通过动态光散射技术测量两种
mRNA-LNP
的平均粒径分别为
98.16 nm
和
89.11 nm
；使用
Quant-iT RiboGreen RNA Kit
检测
mRNA-LNP
的包封效率，包封率均超过
90%
（图
1d
）。透射电子显微镜（
TEM
）分析显示，
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
颗粒呈均匀的实心球形形态，表明两种四价
mRNA
的
LNP
形态保持稳定（图
1e
）。
综上，
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
能有效在体外表达
MPXV
的
A29L
、
A35R
、
M1R
和
B6R
蛋白，包封率高且形态稳定。
图
1 mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
的设计与包封
本
研究评估了
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
在小鼠中的免疫原性和有效性（图
2a
）。小鼠两次接种
mRNA-A-LNP
或
mRNA-B-LNP
，
间隔
14
天，未接种小鼠作为对照组
，首次
接种后
第
10
天和
24
天收集小鼠血清
（图
2a
）
。
ELISA
评估针对
MPXV
四种
抗原的结合抗体反应
，
所有接种疫苗的小鼠均检测到针对四种靶抗原的抗体，并且随着免疫次数的增加，抗体水平显著上升（图
2b-e
）。
使用
VACV
天坛株进行活病毒中和实验
以
评估中和抗体反应。在初次接种后，中和抗体滴度略高于检测限，加强免疫后，中和抗体滴度提高了近
2
log10
（图
2f
）。
两种
测试结果
显示
，
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
之间的
体液反应没有显著
的
统计
学
差异。
综上
，
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
均
能够诱导
抗
MPXV
的
IgG
抗体和抗
VACV
的中和抗体
，且诱导小鼠产生体液免疫的效力相当
。
图
2
接种
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
的
小鼠体液免疫反应
T
细胞免疫对抗病毒感染至关重要，
研究人员
进一步
探索
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
免疫是否能够引发
MPXV
特异性的
T
细胞免疫。酶联免疫斑点（
ELISPOT
）结果显示
，
在接种疫苗的小鼠脾脏细胞中，
IFN-γ
（
Th-1
）、
TNF-α
（
Th-1
）和
IL-2
（
Th-1
）的分泌显著增加
，而
IL-6
（
Th-2
）分泌水平
无
显著差异（图
3a
）。
MPXV
感染主要
由
抗体控制，
而
记忆
B
细胞和记忆
T
细胞在猴痘疫苗的体液免疫反应中发挥
着
重要作用。通过
测量
MPXV
特异性的生发中心
（
GC
）
B
细胞、滤泡辅助
T
细胞（
Tfh
），以及
CD4+
和
CD8+
效应记忆
T
细胞（
Tem
），评估
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
诱导记忆细胞反应的能力。流式结果显示，与未接种
MPXV
特异性抗原刺激
的小鼠相比，
接种
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
小鼠
的
引流淋巴结（
DLNs
）中
MPXV
特异性的
GC B
细胞和
Tfh
细胞显著增加（图
3b-c
）
。
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
在诱导
MPXV
特异性的
CD8
+
Tem
细胞比
CD4
+
Tem
细胞更为有效（图
3d-e
）。
综上，
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
疫苗成功诱导了基于
Th1
的
MPXV
特异性细胞免疫反应
，并
引发记忆
B
细胞
和记忆
T
细胞效应。
图
3
接种
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
小鼠的
MPXV
特异性细胞反应
本研究
基于萤火虫荧光素酶表达的
VACV
攻毒
模型评估
mRNA-A-LNP
和
mRNA-B-LNP
在小鼠中的保护
作用
。主动保护评估
实验中，
两次肌肉注射
mRNA-A-LNP
或
mRNA-B-LNP
的小鼠
，
皮下注射
攻毒
VACV
天坛株，
24
小时
后
通过生物发光成像
（
BLI
）
测量小鼠的病毒
载量，结果显示
接种疫苗的小鼠中生物发光信号几乎
不可
检测，而未接种小鼠的信号值高达
6.5 log10
（图
4a-b
）。
进一步
评估免疫小鼠血清
在
体外和体内
被动
保护
效果，
在体外将免疫小鼠血清与
VACV
共
孵育
1
小时，生物发光信号在免疫血清处理的小鼠中显著减弱（图
4c-d
）
；在
体内，
裸鼠
注射
免疫小鼠的
血清
，再注射
VACV
，免疫血清处理的裸鼠仅在注射部位检测到微弱的荧光信号，而未
免疫
小鼠血清处理的
裸鼠
检测到
明显的
荧光信号（图
4e
、
f
）。
综上
，
疫
苗诱导的抗体在
攻击
后迅速清除
VACV
，具有主动保护作用；
免疫小鼠的血清在体外能有效中和
VACV
