评估了树脂配体密度对制备单克隆抗体纯化过程中阳离子交换色谱性能的影响。使用具有独特杂质谱的三种不同单克隆抗体测试了一组跨越相对较宽配体密度范围的琼脂糖基阳离子交换树脂。实验在结合和洗脱模式下进行，在中等蛋白质负载量和接近饱和容量下使用梯度洗脱。在任何测试条件下，配体密度都不影响高分子量变体的清除；然而，在一种情况下，配体密度确实影响了基本电荷变体的分辨率，而在另一种情况中，配体密度改变了宿主细胞蛋白质的清除率。总的来说，结果表明配体密度、保留和分辨率之间的关系受到特征电荷和蛋白质表面电荷分布的影响。
阳离子交换色谱法通常用作重组单克隆抗体纯化过程中的下游精纯步骤。该装置操作的要求可能包括去除与产品相关的杂质，如聚集物和非产品相关杂质，如宿主细胞蛋白（HCP）和浸出蛋白A。虽然上游亲和层析步骤通常将非产品相关杂质去除到痕量水平，但制备纯化过程通常依赖于阳离子交换步骤将聚集体和其他高分子量（HMW）物质去除到对人类治疗应用安全的水平。工艺开发人员面临着设计下游工艺的挑战，这些工艺在提供稳健的杂质清除的同时，最大限度地提高产品产量，最小化原材料成本，控制循环时间，并在工厂限制范围内运行。
目前，可用于大规模纯化过程的商用阳离子交换树脂数量不断增加。这些树脂在物理特性上存在广泛差异，如粒径、孔径和几何形状、配体密度以及基质化学性质。尽管这些产品的多样性为筛选性能更优的树脂提供了机会，但树脂性能与性能之间的关系尚不完全明确。特别是，对于大规模单克隆抗体纯化过程，配体密度对杂质清除率的影响尚未进行系统研究。
配体密度已被证明会影响离子交换色谱中的蛋白质保留和传质特性。Wu和Walters观察到溶菌酶和细胞色素c在一组具有不同配体密度的五种硅基阳离子交换树脂上的洗脱顺序发生了变化；细胞色素c在配体密度较低的树脂上首先洗脱，而溶菌酶在配体密度较高的树脂上先洗脱。他们还注意到，在较低的配体密度下，谱带明显加宽，这对两种蛋白质的分辨率产生了负面影响。Langford及其同事使用共聚焦显微镜技术表明，树脂配体密度可以影响离子强度，在离子强度下，颗粒内传输从孔扩散切换到均匀扩散机制。Franke等人发现配体密度影响树脂孔隙率和相应的孔扩散率。这些研究表明，在制备阳离子交换过程中，树脂配体密度可能会显著影响靶蛋白和杂质的分辨率；然而，目前尚无直接证据支持这一结论。
蛋白质聚集体等高分子量物种在工艺开发过程中可能会带来特别有趣的挑战，因为它们可能具有与单体靶蛋白类似的三级结构和等电点（pI）。Suda等人指出，阳离子交换树脂上单体和聚集体的特征电荷存在显著差异，这表明推动这两种物质分解的机制主要是静电。然而，SP-SepharoseTM FF和SP-SepharoseTM XL的比较研究表明，尽管在SP-SepharoseTM XL上重组单克隆抗体的单体形式和聚集形式之间的特征电荷（也称为蛋白质有效结合电荷）差异较大，但两种树脂的分离性能相似。这与Wu和Walters的工作是一致的，他们的结论是，保留与特征电荷并不完全相关，必须受到其他因素的影响。DePhillips和Lenhoff比较了几种模型蛋白质在一系列商业树脂上的保留，并得出结论，配体类型（磺丙基与羧酸盐）和孔径是阳离子交换色谱中蛋白质保留的主要决定因素。显然，树脂性能与树脂性能之间存在着复杂的关系；如果不使用复杂的建模技术或仅在设计的一个方面有所不同的树脂原型，就很难理解单个特征（如配体密度或孔几何结构）在实际分离过程中的作用。
这项工作的目的是阐明配体密度在阳离子交换色谱操作中的影响。这是通过使用一系列仅在配体密度上不同的原型制备树脂来实现的。将树脂装入具有代表性床层高度的柱中，并在结合和洗脱模式下进行实验。使用三种具有相对高水平的产物相关杂质和宿主细胞蛋白的单克隆抗体原料，试图确定配体密度变化引起的产量和杂质清除率的变化。在所有情况下，树脂都在中等负载密度下运行，并且接近容量，以便在与大规模生化制造工艺相关的条件下对树脂性能进行有意义的评估。
配位体密度对制备型阳离子交换色谱的选择性有影响，但这种影响的性质和程度取决于原料。根据这项工作的结果，随着配体密度的增加，分离性能可能会提高、下降或保持不变。这可以用一种具有三种主要变体的单克隆抗体来说明：单体3LC（175 kDa）和一种基本电荷变体。随着配体密度的增加，单体和电荷变体的分辨率提高，但电荷变体和3LC的分辨率变差。单体和3LC的分辨率不随配体密度而变化。在这种情况下，从工艺开发的角度选择理想的配体密度将取决于电荷变体是否被视为杂质。第二抗体的实验是一致的，因为随着配体密度的增加，高分子量变体（在这种情况下，共价聚集体）的清除率没有变化。配体密度和分辨率之间的关系并不简单，可能会受到正在加工的单个蛋白质物种的生物物理特性的影响；然而，单体和高分子量抗体形式的分辨率似乎对配体密度不敏感。
在这项研究中，分离性能的变化似乎是由于保留率的变化而不是传质效应的变化，例如树脂珠表面的空间位阻。这是证明的事实，动态结合能力增加了整个配体密度范围内检查；若配位体密度影响到树脂孔的传输，DBC1%预计会降低。此外，本研究中观察到的HMW变异和HCP清除率在低（10或15 g/L）和高（DBC1%的80%）蛋白质负荷密度下相似。这些数据表明，虽然可以定制树脂配体密度以在某些情况下调整工艺性能，但使用配体密度高于内在蛋白质保留率显著变化水平但低于质量传输受阻水平的树脂将产生更稳健的工艺。对于此处使用的原型树脂，该范围似乎约为100–150 meq/L。
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