转自:吉凯基因
高分高分高分!
上图展示今年以来CRISPR文库相关IF>20的文章列表的1/4。 这两年,CRISPR/CAS9火到让人习以为常。
利用其多方面的潜能,各种工具被开发出来,给科研工作者在生物体各个层面涂涂改改做研究提供了极大便利。简单列举如下表:
● DNA水平,可以实现精确基因编辑,大片段、单碱基都能hold住!
● RNA水平,转录调控RNA上下调,RNA干扰全都搞的定!
● 表观遗传水平,调控DNA碱基甲基化不是梦!
● 还有分子定位, 基因检测(SHERLOCK) 等等等等
更关键的是,这些工具不仅可以对单分子进行操作,更强大到可以在组学水平进行全面筛选——那就是CRISPR相关文库。
今天小编尝试由浅入深,跟大家聊聊CRISPR文库。
第一步:引发双链DNA断裂(DSB)
简单来说,CRISPR/CAS9系统是蛋白-RNA复合体(RNP),两者结合,一起发挥功能:
● sgRNA,通过与DNA碱基互补配对将RNP定位于基因组
● Cas9,核酸内切酶,切割DNA双链诱发DSB(红色箭头)
至此,CRISPR/CAS9系统的使命——瞄准了,切两刀,结束。
第二步:利用细胞DSB修复机制——编辑基因组
CRISPR/CAS9造成一个DSB,而真正帮助我们实现目的的,其实是细胞本身的DNA修复机制:
● 无模板,非同源介导的基因编辑(NHEJ),不精确,引发移码突变,实现基因敲除(KO,Loss of Function)
● 有模板,同源介导的基因修复(HDR),精确编辑
一点点补充:
● 有很多CRISPR系统只需要瞄准了,即精确结合到DNA(或RNA)上;
● 不需要切两刀,即通过点突变将CAS9的2个核酸内切酶相关功能域失活;
● 通过与CAS9融合表达另外一个功能蛋白(心有多大,舞台就有多大),实现其他功能,简单列举如下:
附:SAM/Sun-tag/CRISPRa
下面我们以CRISPR/CAS9本体用于基因功能研究为例接着聊。
二CRISPR/CAS9介导的基因敲除——强大的Loss of Function功能研究工具
说起Loss of function,必提RNA干扰。那么,比一比?
● RNA干扰残留目的基因仍旧可能维持其功能(图左)
● CRISPR/CAS9可将基因完全消除进而揭示其功能(图右)
先看流程
● 如果CAS9和sgRNA通过两个载体导入细胞,那么需要就叫做“双载体”系统,看左边。
● 如果CAS9和sgRNA通过一个载体导入细胞,那么需要就叫做“单载体”系统,看右边。
筛选原理?
主要原因是利用了慢病毒整合基因组的特性,以单载体文库说明:
一定用慢病毒?
除了整合的特性,慢病毒还有如下特点,让你不得不爱:
用RNAi文库也可以进行Loss of Function筛选啊?
那我们对比一下RNAi和CRISPR/CAS9如下:
针对同一基因多靶点表型一致性这一关键数据,来源是Science:
所以,CRISPR/CAS9可能更有优势哦~
做好CRISPR/CAS9文库筛选实验的关键是什么呢?
结合流程,细胞感染、药筛、收取细胞进行NGS都算是比较常规的操作,关键在:
CRISPR/CAS9文库过关!具体来说:
a. 特异性要高,脱靶率要低,活性还要高。
b. 尽量选择多个转录本的共有外显子。
a. 虽然张峰库靶点有效率平均高达80%(见下图),但还是需要多靶点设计保证针对每个基因都有有效靶点。
b. 若基因敲除后有功能,多靶点可以互相印证,避免脱靶带来的假阳性
像张锋的human GECKO文库,大概有12万+条sgRNA,经过质粒构建、质粒扩增,必须经过NGS测序确保达到以下的高标准:
a. 左图,高覆盖率。质粒扩增后经NGS,测到的sgRNA覆盖率要争取向“24K”的标准看齐——99.99%。
b. 右图,高均一度。不同sgRNA靶点含量差距不能太大。
在文库筛选过程中,我们期望除了药物,其他刺激的影响越小越好。所以病毒必须高滴度、高纯度、无污染:
更重要的是,慢病毒文库也必须有向24K看齐的高覆盖率和高均一度。 下面是慢病毒感染细胞后抽取基因组NGS的慢病毒文库质检结果。
OK,经过两轮NGS测序,我才拿到了可以放心实验的CRISPR慢病毒文库。
前面虽然说简单说说,现在也还越发觉得不简单。反正我是觉得,如果让我自己做个慢病毒文库,简直跟读了半个博一样。
科研需要CRISPR慢病毒文库怎么办?
现在来说说我的老东家吧,下面是广告~
前面这些硬货干货,都是我在老东家耳濡目染接触到的,
数据也都是同事实打实一枪一枪、一盘一盘、一lane一lane做出来的,
为了做好CRISPR文库,
他们可谓是匆匆忙忙、没白没黑、试了又试,
最近看到他们躁动在周围蹦来跳去、时不时还亢奋的喊:
我们要成为国内CRISPR文库NO.1的专家!
不管是从头开始定制一个文库还是要张锋的现货文库,
不管是基因敲除文库还是SAM过表达文库,
不管是人、小鼠、大鼠还是猪牛羊、河豚或草泥马,
我们都肯定是速度最快、质量最好、性价比最高、服务最优!
看到他们的状态,我是信了。
各位看官信或者信,都可以扫下面的二维码看看,
趁他们疯之前!