同源重组实验中，质粒为什么要「挑单克隆」，冻存的菌液是否需要再次挑单克隆？

NIRO科研喵 · 公众号 · · 2024-12-11 07:45

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作者 | NIRO

来源 | NIRO（ID：NIRO-keyanmiao）

编辑 | 澹泊研究僧

在构建质粒后，我们导入感受态细胞(《如何高效制备「感受态细胞」？这份Protocol必须收下... 》)中，进行转染，然后挑单克隆，进行菌落PCR鉴定，验证质粒构建是否成功。

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为什么会写这篇文章呢？因为有朋友问NIRO，同一质粒，有两个单克隆都连接成功了，可以将同一质粒的两个不同的克隆混在一起进行扩增呢？

显然答案是否定的！

在质粒构建过程中，为什么要挑单克隆？

质粒在细菌细胞中复制扩增时，可能会产生一些突变或重组。选取单克隆可以确保获得的质粒来自于同一个起始质粒，减少了混杂基因型的风险，确保基因序列的准确性。如果不挑单克隆，可能会出现多个质粒的混合情况，会增加质粒的突变风险。

单克隆培养也意味着所有细菌细胞都携带相同的质粒，这样可以确保后续的实验在相同的遗传背景下进行。特别是在进行蛋白表达实验时，质粒的拷贝数和基因表达水平直接影响实验结果。

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那么，用甘油储存的甘油菌需不需要在固体培养基中再次挑选单克隆？

主要从两方面进行考虑: 一方面，如果甘油菌是用于质粒构建的，那么每次从冻存中取出后，最好进行单克隆筛选。这是因为质粒在细菌中复制扩增时，可能会产生突变或重组，通过单克隆筛选可以确保载体在一代代的重组后，突变程度最小。

另一方面，如果甘油菌已经经过验证、序列确认，并且不用于质粒构建，而是直接用于扩增，那么通常可以直接使用，而不必每次都进行涂板单克隆选择。但是，即使在这种情况下，也建议定期对质粒进行序列验证，以确保质粒在储存过程中没有发生突变。

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甘油管中保存的菌液在-80°C条件下稳定性较高，短期内不会轻易发生突变或丢失质粒。即使直接用储存菌液，也建议定期对质粒进行序列验证，特别是在长期储存后重新使用时。菌液存储时间越长，质粒突变的可能性越大，所以每隔几次扩增后可以考虑重新涂板挑选单克隆。

对于高拷贝数质粒，丢失的可能性较低，因此可以考虑直接从储存菌液中扩增，但仍需定期筛选单克隆，以确保质粒没有发生突变。低拷贝数质粒相对不稳定，直接从储存菌液中扩增的风险较高，通常建议在这种情况下每次都重新涂板筛选单克隆。另外，在操作过程中，每次扩增时如果不涂板筛选单克隆，可能会带来污染的风险。如果使用的储存菌液中含有其他细菌或质粒，会影响实验的准确性。定期进行单克隆筛选有助于降低这种风险。