基因治疗（Gene Therapy）是指将外源基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷或基因表达异常引起的疾病。腺相关病毒（AAV）作为基因治疗的一种明星载体，对于人类攻克癌症或更多的重大疾病有着巨大的潜力。（AAV载体更多详细内容请参见：
基因治疗的好帮手—腺相关病毒
）
为产生重组腺相关病毒(rAAV)，哺乳动物或昆虫细胞通常需要共转染两个或者三个质粒——其中一个或两个质粒提供AAV包装复制元件和腺病毒辅助元件，另外一个质粒(AAV质粒)包含两端带有ITR序列的目的基因表达框。
图1：AAV病毒基因组结构（图片来源：参考资料[1]）
AAV质粒中ITR区域的完整性对rAAV的产生至关重要。缺失突变的ITRs会降低完整AAV病毒的产量，增加非目的DNA包装的产生1。然而，在使用大肠杆菌进行质粒扩增过程中，AAV质粒的ITR区域经常发生突变。研究表明，ITR序列的不同区段（A-A’ region，B-B ’region， C-C’ region以及D region）缺失，都会对rAAV的产生造成影响。对AAV质粒的ITR序列进行准确的分析将会对rAAV的质控具有重要的意义。
图2：AAV2的ITR序列的示意图。ITR由两个臂回文(B-B'和C-C')和一个长茎回文(A-A')组成。D序列在AAV基因组的每一端只出现一次。
目前，rAAV质粒主要在细菌中扩增。然而，由于细菌中同源重组系统，ITRs经常发生重排。细菌繁殖后，rAAV质粒中最常见的突变之一是ITR的B-B’或C-C’臂缺失(图2)。这种缺失使T型ITR发夹的茎更长，比野生型ITR更加稳定。
图3：AAV2的ITR区域中B-B’臂缺失的示意图。野生型AAV2的ITR区域是一个125bp的T型发夹结构，而缺失突变的ITR是一个103bp的发夹结构，其茎部更长。
针对ITR易缺失的特性，科学家们一直努力寻找能使rAAV质粒的ITR在细菌中保持稳定扩增的方法，现在市场上使用较多的方法是通过使用特殊的大肠杆菌细胞来保持其稳定。市场上目前反馈比较好的，有来源于I公司的S13和S14，它被设计为专门克隆不稳定基因（如包括有正向重复的慢病毒DNA），还有很多客户根据在多年AAV方面研究的经验，也会使用B83 (来源于A公司)、D10(来源于I公司)和S2(来源于A公司)等大肠杆菌细胞。
GENEWIZ通过专利的ITR测序方法（该方法可以测通野生型ITR序列以及更有挑战性的缺失突变的ITR序列，能帮助定性评估ITR区域甚至是缺失突变ITR区域的完整性）和大量的rAAV质粒构建经验，发现这些细胞的效能也是有限的，并不能普遍稳定不同的rAAV质粒（表1）。
为此，GENEWIZ开发了一套针对rAAV质粒构建、错误ITR的修复和rAAV质粒大量制备的方法——Hi-Fi技术，该方法的核心点不仅仅是制定了更简单、灵活和快速的克隆方案，而更重要的是发明了一种特殊的大肠杆菌细胞及其配套使用的AAV稳定剂，较现有的方法更能使rAAV质粒的ITR在细菌中扩增过程中保持稳定，不易再发生缺失（表1）。
表1：5个随机AAV构建后ITR的正确性
基于感受态细胞的对比数据，我们进一步探索了Hi-Fi技术流程在转化筛选正确克隆过程中的能能力。由于ITR本身的不稳定性，在质粒构建的过程中，会有发生突变的可能性。
目前金唯智基于Hi-Fi技术可以提供rAAV的质粒构建，ITR区域的修复和rAAV质粒大量制备以及AAV病毒包装等相关服务。
