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编译：微科盟Lili，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。
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导读
紫色红曲菌（
M.purpureus
）发酵红葡萄柚过程中，风味化合物和代谢轮廓经历了复杂的变化，但这些变化的具体细节尚不清楚。本研究旨在探究这一发酵过程中风味化合物和代谢特性的变化。我们采用非靶向代谢组学方法，利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术（HS-SPME-GC-MS），分析了发酵过程中的风味化合物，并测定了整个发酵期间的物理化学指标。在发酵前后，我们鉴定出23种挥发性风味代谢物，重点关注酸类、醇类和醛类，其中9种代谢物的含量上升，14种含量下降。涉及的主要代谢途径包括丁酸、牛磺酸和亚牛磺酸，丁酸途径中丙酮和1-丁醇的表达水平显著下调。研究揭示，丁酸代谢可能影响紫色红曲菌中的其他代谢途径，如糖酵解、脂肪酸代谢和三羧酸循环。这些发现为发酵过程中风味化合物的生成提供了见解，并为发酵柑橘类水果的工业生产提供了理论基础。
亮点：
1、物理化学指标表明，在发酵过程中风味化合物发生了变化。
2、代谢组学分析鉴定出23种代谢物，包括酸类、醇类和醛类。
3、观察到的主要代谢途径包括丁酸、牛磺酸和亚牛磺酸。
4、在丁酸代谢途径中，丙酮和1-丁醇的表达水平下调。
5、丁酸代谢可能影响紫色红曲菌中的其他代谢途径和酶。
原名：
Identification of
characteristic volatiles and metabolomic pathways during the fermentation of
red grapefruit by
Monascus purpureus
using HS-SPME-GC–MS and metabolomics
译名：
采用HS-SPME-GC-MS和代谢组学方法研究紫色红曲菌发酵红葡萄柚过程中的特征挥发性物质及代谢途径
图1A显示，在整个发酵过程中，实验组相对于对照组显示出明显的黄色素形成抑制作用。黄色素对产量的抑制效果在预发酵和后发酵阶段更为显著，而在中期发酵阶段则不太明显。在发酵的第2天，实验组产生了4.06 U/mL的黄色素产量，比对照组低33.6%。在发酵的第15天，实验组产生了4.06 U/mL的黄色素产量，比对照组低21.4%。图1B和C显示，实验组在发酵的早期和晚期对橙色素和红色素产量有特定的抑制作用，而在发酵的中期与对照组相比显示出一定的促进作用。然而，市场影响并不明显。在发酵的第2天，实验组产生了2.8 U/mL的橙色素产量，比对照组低33.2%。在发酵的第15天，实验组产生了13.8 U/mL的橙色素产量，比对照组低15.3%。在发酵的第2天，实验组产生了3.7 U/mL的红色素产量，比对照组低26%。在发酵的第15天，实验组产生了15.2
U/mL的红色素产量，比对照组低13.4%。
图1 展示了发酵过程中物理化学指标的变化情况（A：黄色素，B：橙色素，C：红色素，D：莫纳可林K，E：柚皮素含量，F：黄酮类含量，G：多酚类含量。*表示显著性差异p ≤ 0.05，**表示显著性差异p ≤ 0.01，***表示显著性差异p ≤ 0.001）。
红葡萄柚作为发酵基质，富含天然活性物质，如香豆素、膳食纤维、维生素C和柚皮素，这些物质为紫色红曲菌的生长和代谢提供了充足的底物，并影响其代谢产物的调控途径。Wei等人在红曲发酵液中添加外源性抗坏血酸，观察到对次级代谢产物的产生，包括红曲色素和橘霉素，有适度影响。因此，我们假设黄酮类化合物如柚皮素和抗氧化物质如维生素C的存在，不利于发酵条件。这影响了真菌的生长和代谢，可能影响红曲色素生成过程中涉及的反应。因此，红曲色素的产量可能受到影响。
如图1D所示，除了发酵第8天之外，实验组在整个发酵阶段的黄色素合成量较对照组有显著增加。在发酵第8天，实验组的莫纳可林K含量相对于对照组表现出抑制效应；然而，观察到的差异在统计学上并不显著。在发酵第8天，实验组的莫纳可林K浓度为10.5 mg/L，比对照组低30%。在发酵的中期和后期，莫纳可林K的浓度出现了显著且迅速的增加。其中，第15天的样本浓度最高，达到53.23 mg/L，比对照组增加了51%。
近期，研究人员致力于通过替换培养基或在传统培养基中添加特定量的有益化学物质来提高莫纳可林K的产量。Ouyang等人观察到，在红曲培养基中添加染料木黄酮可以促进次级代谢产物的合成，如红曲色素，并抑制橘霉素的形成。Huang等人同样证实，通过在红曲培养基中添加大豆异黄酮也能取得相同效果。Peng采用多种山药作为发酵基质，通过红曲发酵，并在添加特定量的木犀草素和染料木黄酮后观察红曲的次级代谢产物生产。结果表明，山药作为发酵基质，对红曲的生长和次级代谢产物的生成有明显影响。此外，向培养基中引入一定量的活性物质的效果更为显著。向培养基中添加特定量的活性化学物质已被观察到具有更显著的效果。总之，红葡萄柚是一种新型发酵基质，包含多种活性物质，如豆球蛋白、膳食纤维、维生素C和黄酮类化合物。这些物质提供了丰富的营养物质，有助于红曲的生长和代谢过程。利用基质中的营养物质使红曲能够增强生长和次级代谢产物的产量。
如图1E所示，在发酵前期和中期，实验组的黄酮类化合物含量与对照组相比显著增加，而在发酵后期则明显下降。然而，这些抑制效应并不明显。具体来说，在发酵第8天，实验组的黄酮类化合物含量比对照组增加了66.7%，达到1.03 mg/mL。到了发酵第15天，黄酮类化合物的浓度降至0.59 mg/mL，比对照组低15.7%。
因此，我们推测在发酵初期和中期产生的β-葡萄糖苷酶等酶活性增强，这可能影响了紫色红曲菌中与黄酮类化合物生成相关的代谢途径，从而间接增加了发酵液中黄酮类化合物的含量。在发酵后期，紫色红曲菌依赖黄酮类化合物来维持其发育，并促进次级代谢产物的生成，导致黄酮类化合物水平下降。
图1F清晰地展示了整个发酵过程中，以1 mg/mL浓度表示的多酚类含量的波动情况。我们在发酵的中后期观察到轻微增加，但这一增加并不显著。在发酵过程中，对照组和实验组的多酚水平保持稳定，没有出现显著的波动。多酚类物质包含具有抗氧化特性的次级代谢产物，并参与多种生物过程。此外，某些植物和真菌中的多酚氧化酶（金属酶）通过促进多酚的羟基化和氧化，参与代谢过程。Zheng等人从药用真菌（鲍姆桑黄菌）中分离出特定量的多酚，并证实了其抗氧化效能。真菌中多酚的合成过程与植物不同，其代谢途径尚不清晰，许多基因缺乏功能注释。因此，我们假设紫色红曲菌可能选择性地利用替代物质进行生长和次级代谢产物的合成。或者，由真菌合成和消耗的多酚可能相似，导致其浓度变化不大。
图1G清晰地展示了整个发酵过程中，实验组的柚皮素含量在第2天、第8天和第12天均高于对照组。然而，在第5天和第15天，实验组的柚皮素水平低于对照组。在发酵的第8天，促进效应最为显著，实验组的柚皮素含量达到2.9 mg/mL，比对照组高出81.3%。到了发酵的第15天，抑制效应最为显著，实验组的柚皮素含量为1.6 mg/mL，抑制率达到44.8%。
柚皮素是一种二氢黄酮类化合物，属于天然黄酮类化合物的一种。它在柚子皮中含量丰富。Zhang等人发现，柚皮素能够调节经柚皮素处理的细胞中的三羧酸循环、谷氨酸代谢以及其他几条代谢途径。由于三羧酸循环对真菌生长和代谢具有重要影响，其中三羧酸循环影响紫色红曲菌中次级代谢产物的产量。因此，我们推测，在预发酵阶段，紫色红曲菌可能利用柚皮素进行代谢性生长。此外，在发酵中期，紫色红曲菌可能产生了特定量的柚皮素。进一步地，在发酵后期，紫色红曲菌可能回收利用柚皮素以维持其生长，并促进次级代谢产物的合成。
如图2A所示，在发酵第二天，我们共鉴定出89种挥发性风味化合物，其中萜烯类含量最高，占33.71%，其次是醇类和酯类，分别占20.34%和4.75%。到了发酵第五天，我们共鉴定出94种挥发性风味化合物，其中烯烃类含量最高，达到34.61%，其次是醇类和酯类，分别占16.88%和11.22%。在发酵第八天，我们共鉴定出82种挥发性风味化合物，烯烃类含量最高（37.26%），其次是醇类和酯类（分别为22.74%和5.97%）。在发酵第十二天，我们共鉴定出70种挥发性风味化合物，烯烃类含量最高，为52.41%。其次是酚类和醇类，分别占9.24%和7.99%。在发酵第十五天，我们共鉴定出102种风味化合物，其中醇类含量最高，为40.52%，其次是酯类、酮类和烯烃类，分别占10.67%、6.66%和5.99%（附录A）。
图2 展示了化合物相对含量和模型相关性分析（A：化合物相对含量，B：主成分分析（PCA），C：偏最小二乘法判别分析（PLS-DA））。
在发酵过程中，萜烯类化合物的含量在预发酵阶段表现出最大的变化，在发酵后期观察到最低水平。醇类化合物的含量在整个发酵周期中呈现出一致的趋势，其中在中后期发酵阶段观察到最高水平。烯烃类化合物在发酵的中晚期被观察到。在中期阶段，烯烃含量有所增加，而在后期阶段则显著下降。酯类化合物的含量通常在发酵的早期和晚期较高，而在中期相对较低。酮类和酚类化合物的含量在发酵的后期阶段表现出明显的增加。
萜烯类化合物是红葡萄柚固有的挥发性成分，也是红葡萄柚发酵基质的组成部分。在发酵初期，紫色红曲菌主要利用红葡萄柚中的糖分进行生长和繁殖。萜烯类化合物的代谢活动较弱，因为这些化合物尚未经历显著的代谢转化，含量仍然较高。已有研究表明，微生物拥有独特的酶系统，有助于萜烯类化合物的环化作用。因此，我们推测在发酵中期和后期，紫色红曲菌开始利用萜烯类化合物进行自身的生长代谢，导致萜烯类化合物被消耗。醇类化合物在整个发酵周期中含量显著，源自多不饱和脂肪酸的脂氧合酶。此外，它们也是葡萄糖降解和氨基酸分解的常见最终产物。红葡萄柚是营养物分解为醇类、醛类和其他化合物的丰富来源，这些分解作用由多种细胞质酶促反应，包括脱氢酶和转氨酶。
在发酵过程中，糖是维持紫色红曲菌生长和代谢的主要碳源。糖的持续消耗和酒精的产生有助于维持酒精含量的稳定。烯烃含量的增加可能与微生物的代谢活动有关。在发酵中期，紫色红曲菌可能通过利用红葡萄柚中存在的某些前体物质来合成烯烃。这些烯烃可能作为代谢过程中的中间体，在发酵的后续阶段被紫色红曲菌进一步代谢或转化。因此，烯烃含量显著降低。醛类可能源自紫色红曲菌的代谢活动。然而，它们在发酵过程中可能不稳定，容易氧化成相应的羧酸或还原为醇类，这有助于解释在发酵过程中观察到的高酒精含量。随着发酵的继续，紫色红曲菌可能开始利用各种前体物质合成酮类，导致其浓度增加。这一现象有助于解释在发酵的后续阶段观察到的酮水平升高。微生物可以合成酯类。因此，我们推测在预发酵和后发酵阶段，紫色红曲菌合成了更多的酯类，而在发酵中期，酯类可能被用作合成其他物质的前体或用于自身的生长和代谢。
紫色红曲菌利用红葡萄柚中的碳水化合物、蛋白质等大分子营养物质进行水解，产生初级代谢产物，这些初级代谢产物随后被进一步代谢，生成多种挥发性风味物质。因此，在红葡萄柚发酵过程中，不同挥发性风味化合物浓度的变化是由于紫色红曲菌的代谢过程与发酵基质特性共同作用的结果。
