国自然申请 | 研究“蛋白与RNA互作”的几种经典技术以及注意事项

说明：

1. RNA 与蛋白互作可以从 RNA 和蛋白这两个角度展开。从 RNA 的角度来说： RNA 与蛋白的互作可用于解释 RNA 的稳定性变化、 RNA 翻译、 RNA 定位等过程，因此在进一步研究 RNA 与蛋白互作之前， 一般都要先确认 RNA 本身发生的这些改变，特别是有不少项目关注的是 RNA 修饰（比如 RNA m7G 等） ，然后再通过与之结合的蛋白进一步说明具体的方式（ RNA 结合蛋白）； 另外一个角度就是蛋白 ，虽然主要是 RNA 结合蛋白这一类，但由于 RNA 结合蛋白类型很多，还要具体分类，比如 RNA 修饰 Reader 蛋白、翻译因子、 RNA 转运蛋白等等；

2.虽然现在有很多在线工具可以预测 RNA- 蛋白互作，但是这些工具大多有一个缺陷 ：没有考虑到组织或者细胞特异性，即虽然预测到某个 RNA 与蛋白可能结合（甚至有很高的 “ 打分 ” ）， 但不能说明在申请人研究背景下（比如在心肌细胞、巨噬细胞）也能结合 ，比如有的蛋白或者 RNA 可能有很高的组织表达特异性（组织或者细胞特异性表达的），换个细胞或者组织就不表达了，这也是预测蛋白 - 蛋白互作很常见的一个问题；

3.与之前我们说的蛋白 - 蛋白互作相比，在细胞体系的 RIP-Seq 、 RNA pulldown 这些实验 并不能直接证明蛋白与 RNA 的互作 ，即有可能存在介导 RNA 与蛋白互作的间接介导因子 B ，即 “RNA— 间接因子 B— 蛋白 ” 这种模式，而非 “RNA— 蛋白 ” 的作用方式，因此还需要在非细胞体系下进一步证明；

4. 像 RNA pulldown 和 RIP-Seq 这种技术多数情况下鉴定到的是 RNA 或者蛋白整体的结合，基本做不到氨基酸或者核苷酸分辨率的结合 ，因此如果要进行深入的机制研究， 还需要对 RNA 和蛋白进一步进行截断实验和突变，从而确认具体的作用位置、结构域和位点 ；

5. 其它的一些问题与蛋白 - 蛋白互作等很像，即要确认 RNA 与蛋白的互作，一般都需要几个方式一起来证明， 如果只用一个技术来证明，很容易被质疑， 比如有很多项目中证明 RNA 与蛋白结合，只有 RIP-Seq 和 RNA pulldown 就是不严谨的。

6.由于 RNA pulldown 、 RIP-Seq 这些技术主要是用于筛选的，因此后续一般也要通过 WB 、 PCR 或者 qPCR 等进行验证， 而有很多项目在预实验层面会出在分组设置上，比如缺少 Input 、 IgG 对照、 Negative/ Scramble 阴性对照和阳性对照，这也是很多专家提出质疑的细节地方 。

下面我们简单介绍一下这些技术， 由于这些技术基本都是比较经典的，我们就不说的太详细了：

一、 RNA pulldown —— MS/WB

RNA pulldown 是一种用于研究蛋白质与 RNA 之间的相互作用的 实验技术 。它的原理基于使用生物素标记的 RNA 探针作为 “ 诱饵 ” ，在细胞裂解液中捕获与之特异性结合的蛋白质。

大致流程： 首先，设计并合成包含特定 RNA 序列的探针，并通过生物素进行标记以便于后续的检测和纯化。接着，将细胞裂解以释放蛋白质和 RNA ，然后与标记的 RNA 探针混合，允许探针与裂解液中的蛋白质相互作用。通过亲和层析技术，如链霉亲和素 - 琼脂糖珠，纯化与 RNA 探针结合的蛋白质。最后，通过 WB 或者质谱等方法鉴定或者验证这些蛋白。

二、 RIP-Seq ( RNA binding protein Immunoprecipitation Sequencing )

RIP-Seq （ RNA 免疫沉淀测序）是一种用于研究蛋白质与 RNA 相互作用的高通量测序技术。其原理是利用特定的抗体捕获与目标蛋白质结合的 RNA 分子，然后通过高通量测序技术对这些 RNA 进行测序和分析。

大致流程： 首先，细胞被裂解以提取蛋白质 -RNA 复合物；然后，使用针对特定 RNA 结合蛋白的抗体进行免疫沉淀，这些抗体能够特异性地识别并捕获目标蛋白及其相关的 RNA 分子；接着，沉淀的复合物被洗涤以去除非特异性结合，然后释放 RNA 并进行纯化；之后，纯化的 RNA 分子被用于构建测序文库，并通过测序技术进行测序；最后，通过生物信息学分析，比较免疫沉淀样本与对照样本的测序结果，以鉴定与目标蛋白质相互作用的 RNA 分子；或者采用 qPCR 方法验证与蛋白结合的 RNA 。

三、 CLIP-Seq （ Crosslinking and Immunoprecipitation Sequencing ）

CLIP-Seq 是一种用于研究蛋白与 RNA 相互作用的高通量测序技术。其原理基于使用紫外线（ UV ）或化学交联剂对细胞进行交联处理，使 RNA 结合蛋白（ RBPs ）与其结合的 RNA 分子形成稳定的复合物，后通过抗体捕获并进行测序，以鉴定与蛋白结合 RNA 的序列位置。

大致流程 ：首先对细胞进行交联处理，使 RBPs 与 RNA 形成稳定的复合物；接着，使用针对特定 RBP 的抗体进行免疫沉淀，捕获这些蛋白质 -RNA 复合物；然后，纯化沉淀的复合物并释放 RNA 分子；之后，将纯化的 RNA 分子用于构建测序文库；最后 进行高通量测序并对测序数据进行生物信息学分析，以鉴定 RBPs 的靶标 RNA 和精确的结合位点（ 大致区域，而不是精确到单个核苷酸水平的信息，如果要到单碱基水平，可以通过 eCLIP/iCL IP 等方法 ）。

四、 RNA 电泳迁移率分析（ RNA Electrophoretic Mobility Shift Assay ， RNA EMSA ）

是一种用于研究蛋白质与 RNA 相互作用的实验技术。该技术基于蛋白质与 RNA 结合后，会形成较大的复合物，其在凝胶中的迁移速率会比单独的 RNA 分子慢。

大致流程：首先，合成或纯化目标 RNA 分子，并对其进行标记，通常使用放射性同位素（例如 ^32P ）或非放射性标记物（如生物素或荧光标记）。接着准备待测的蛋白质， 这些蛋白质可以是纯化的重组蛋白或从细胞中提取的蛋白 。然后，将标记的 RNA 探针与蛋白质混合，并在特定的条件（如适宜的温度、离子强度和 pH 值）下孵育，以允许蛋白质与 RNA 发生结合。孵育后，将反应混合物加载到非变性聚丙烯酰胺凝胶上，并进行电泳。在电泳过程中，由于蛋白质 -RNA 复合物的迁移速率比自由 RNA 慢，它们会在凝胶中形成新的条带。最后，电泳完成后，通过放射自显影、化学发光或荧光成像等适当的检测方法来检测 RNA 探针和蛋白质 -RNA 复合物的条带。通过比较复合物和自由 RNA 的迁移距离，研究者可以判断蛋白质是否与 RNA 发生了结合以及这种结合的特异性。

五、 RNA 与蛋白共定位

与蛋白 - 蛋白共定位相似， 这个实验是从形态上确定 RNA 与蛋白结合的比较重要的实验，因此是国自然项目中“必需”的实验了。 RNA 与蛋白共定位是指在细胞内 RNA 和蛋白质在亚细胞水平上的空间分布和相互作用。

（ 如果基金里面放上这样的图，会不会增加评审专家的印象分？ ）

大致流程： RNA 与蛋白共定位的研究流程首先涉及样本的准备，包括培养细胞至适当密度并对细胞进行必要的处理，如转染、诱导表达或药物处理。接着，通过使用 RNA 标记技术，如荧光原位杂交（ FISH ）或 RNA 与绿色荧光蛋白（ GFP ）融合标签，对目标 RNA 分子进行标记。同时，目标蛋白质通过转基因、 CRISPR/Cas9 系统或免疫荧光技术与荧光蛋白融合或直接标记。然后，利用共聚焦显微镜或超分辨率显微镜对细胞内标记的 RNA 和蛋白质进行成像，捕获它们在亚细胞结构中的分布情况。之后，通过图像分析软件对获得的图像进行定量分析，评估 RNA 和蛋白质的共定位程度和分布模式。