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NF-κB在椎间盘中的过度激活导致巨噬细胞聚集和严重的椎间盘退变

BCML速递 · 公众号 · · 2024-08-11 22:00

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慢性炎症与严重的椎间盘退变（ IVDD ）有关。近日，有研究者通过诱导小鼠模型，基因靶向表达聚集蛋白的细胞，激活经典的核因子 κB （ NF-κB ）通路，研究了 NF-κB 持续激活对 DD 的影响。结果显示， NF-κB 持续激活导致严重的结构性退变，伴随炎症分子（如 Il1b, Cox2, Il6, Nos2 ）、趋化因子（如 Mcp1, Mif ）和分解酶（如 Mmp3, Mmp9, Adamts4 ）基因表达增加。在尾椎间盘中观察到促炎（ F4/80+, CD38+ ）和抑炎（ F4/80+, CD206+ ）巨噬细胞的增加。炎症发生后，尾椎间盘细胞的分泌物增加了巨噬细胞的迁移和炎症激活。腰椎间盘未表现出表型变化，表明脊柱区域对炎症基因过度激活的反应存在差异。最终结果表明， NF-κB 的持续激活可通过增加炎症因子、趋化蛋白、分解酶以及巨噬细胞群体的招募和激活导致严重的 IVDD 。

首先，为了验证 Cre 介导的基因重组在成人 IVD 中的存在，研究者将 AcanCreERT2 小鼠与 Ai14 荧光报告鼠（ AcanCre+/− ； Ai14 ）杂交，并在腹膜内注射他莫昔芬（ Tamoxifen) ）后评估 IVD 。在注射他莫昔芬后，小鼠尾椎间盘和腰椎间盘各组织区域均可见红色荧光蛋白（ RFP ）表达，表明 Cre 重组酶在这些区域成功激活（图 1 ）。

为了验证 Cre 活性下游的 NF-κB 的激活，研究者评估了重组后 1 周在腰部和尾部整个 IVD 中 IKK β基因的表达。结果显示，在 IKKβCA 小鼠的尾椎间盘中， Ikk2 基因表达显著增加约 8 倍，而在腰椎间盘中增加约 3 倍。这表明在尾椎间盘中 NF-κB 活化更为显著。此外， IKKβCA 小鼠尾椎椎间盘中 p65 亚基被激活，在重组后 4 个月和 6 个月通过免疫荧光染色检测到磷酸化的 p65 增加。上述结果表明，该模型在尾侧产生了结构性激活的 IKKβ ，导致下游的 NF-κB 信号通路的激活增强。结果还显示，重组后不同尾侧 IVD 和腰部 IVD 水平的磷酸化 p65 水平随时间而变化（图 2 ）。

接下来，研究者探究了 NF-κB 激活导致的基因表达变化，结果显示 NF-κB 激活后 IKKβCA 小鼠在重组后 4 周内尾椎椎间盘中促炎细胞因子（如 Il1b 、 Cox2 、 Il6 和 Nos2 ）、趋化因子（如 Mcp1 和 Mif ）和分解酶（如 Mmp3 、 Mmp9 和 Adamts4 ）基因表达均显著增加（图 3 ）。

为确定 NF-κB 介导的炎症对尾部静脉完整性的影响，研究者评估了尾侧静脉运动节段的退行性组织形态改变。在重组后 1 个月和 2 个月， IKKβCA 小鼠可以看到轻微的退行性变化，而重组 4 个月和 6 个月的 IKKβCA 小鼠表现出尾部静脉畸形重度 IVDD 的组织学特征。与对照组相比， IKKβCA 小鼠的尾部 IVD 显示细胞密度减少，髓核（ NP ）组织结构丢失，纤维环（ AF ）边界破裂。此外，在 4 个月和 6 个月时， IKKβCA 尾部 IVD 的软骨终板（ EP ）内检测到潜在的浸润性细胞群，尾部静脉畸形邻近生长板（ GP ）内也观察到变性，包括 GP 侵蚀和中断。这些结果表明，长时间的 NF-κB 激活严重影响了 IVD （图 4 ）。

出乎意料的是，与尾部脊柱相反，重组后 6 个月， IKKβCA 小鼠的腰椎 IVD 中没有观察到退行性表型， IKKβCA 和对照腰椎 IVD 都显示出健康的 IVD 结构。尽管之前的验证揭示了 Cre 在整个腰椎 IVD 中的活性，并增加了 Ikk2 和其他几个下游致炎基因的表达，但在腰椎观察到的健康组织病理学表明该模型中 IVD 对促炎信号反应的区域性差异（图 5 ）。

鉴于在尾部静脉畸形中观察到了明显的表型变化，研究者进一步表征了 IKKβCA 小鼠尾部静脉畸形的机械和结构特性的变化。为了确定尾部静脉畸形的变性是否与细胞外基质的变化有关，采用特殊的组织学染色来评估糖胺多聚糖和胶原含量的变化。结果显示， NF-κB 的长期激活有助于细胞外基质的重塑和 AF 组织向 NP 区的移位，后者过渡到纤维化的 NP 结构。总体而言，组织学评估显示 IVDikkβ-NF-κB 过度激活导致严重的 IVDD （图 6 ）。

除 IVD 组织变性外， H&E 染色显示 IKKβCA 尾侧 IVD 所有时间点的外 AF 区细胞密度均增加。为了进一步研究这些细胞群的特性，研究者对泛巨噬细胞标志物 F4/80 进行了免疫染色。结果显示，尾椎间盘中 F4/80+ ， CD38+ 和 F4/80+ ， CD206+ 巨噬细胞的数量增加。通过免疫荧光染色和流式细胞术分析，明确了这些巨噬细胞在不同时间点的变化。结果表明， NF-κB 过度激活不仅引发了炎症，还通过促进巨噬细胞的招募和激活加重了椎间盘的退变过程（图 7 ）。

紧接着，为了确定巨噬细胞对 IVD 微环境的早期反应的可能机制，研究者比较了发炎尾椎间盘细胞和正常细胞分泌物对巨噬细胞迁移和激活的影响。通过体外培养实验，发现发炎细胞分泌物显著增强了巨噬细胞的迁移和炎症激活。这说明发炎的椎间盘细胞通过分泌炎症因子进一步促进了炎症反应的扩展和巨噬细胞的活化（图 8 ）。

最后，为确定 IKKβCA 尾部静脉注射诱导的炎性巨噬细胞表型是否可以逆转，研究者评估了 M2 型巨噬细胞对 IKKβCA 小鼠椎间盘退变的调节作用。结果表明，抗炎巨噬细胞能够通过分泌抗炎因子和调节髓核和纤维环的炎症反应，显著减轻椎间盘退变（图 9 ）。

综上所述，本研究揭示了 NF-κB 在椎间盘退变中的关键作用。通过小鼠模型的实验，证明了 NF-κB 的持续激活会引发严重的结构性退变，并伴随炎症分子和分解酶的基因表达增加。同时，研究表明， NF-κB 过度激活导致巨噬细胞的招募和激活，进一步加重了炎症和退变。这些发现为椎间盘退变的治疗提供了新的思路和潜在靶点。未来的研究可以进一步探索 NF-κB 抑制剂在椎间盘退变治疗中的应用潜力，旨在为患者提供更有效的治疗方案。

这项研究是由来自哥伦比亚大学的 Nadeen O. Chahine 教授团队完成，并于 2024 年 6 月 7 日在线发表于 Science Advances 。

论文信息： Kevin G. Burt ¹ , ^2, Min Kyu M. Kim ¹ , Dan C. Viola ¹ , Adam C. Abraham ³ , Nadeen O. Chahine ^1,2 *. Nuclear factor κB overactivation in the intervertebral disc leads to macrophage recruitment and severe disc degeneration. Sci Adv 2024, 10(23): eadj3194.

供稿：胡杰

审校：李家颖

编辑：季威