从Nature子刊看肿瘤转移研究的套路

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上周文献精读中，酸菜讲解的文献是Nat Commun上的一篇关于肿瘤转移的文献“The mRNA-edited form of GABRA3 suppresses GABRA3-mediated Akt activation and breast cancer metastasis”（回复 “0411” 下载文献）。

这篇文章有两个亮点，第一是讲了个RNA的编辑；第二是这篇文章的数据结构比较简练，容易梳理出逻辑结构。

和之前一样的，先从文章的题目中抓到这么几个关键词：首先研究的核心分子是GABRA3，在前面呢，关键词就是mRNA-edited form，后面呢又有个通路Akt activation，然后疾病呢就是breast cancer metastasis。

这样就把文章的整个框架给出来了，核心分子、疾病、上游调控机制以及下游作用机制都给点了出来。

背景知识

本文在Introduction中对于文章的背景知识做了一些介绍。先是介绍了GABA（γ氨基丁酸），一个氨基酸类型的神经递质，用于信号传递。它的受体有两类，一类是离子通道型的，有GABAa，GABAc；另一类是代谢型受体，GABAb，这篇文章主要研究的GABAa型受体中的一个亚单位——Gabra3。

这个Gabra3之前就有报道存在RNA水平的编辑现象，叫做A-to-I RNA 编辑，就是一个把腺苷（A）脱去氨基，形成肌苷（I）的过程。

文中还提到了GABA和脑转移之间的关系。并且，这种A-to-I的现象虽然有报道，但没有在肿瘤中被研究过，这就是本文的一个创新点。

RNA编辑是在转录水平上对遗传信息进行编码、重编码的过程，从DNA转录到RNA之后，也就是mRNA分子有可能会发生核苷酸的缺失、插入、置换，这样翻译后生成的氨基酸、蛋白质也会发生变化。这A-to-I就是把一个A，编辑成了I，影响了蛋白质的变化，这个过程主要由ADAR1这个酶来介导。

ADAR1有两个转录本：ADAR1p150和ADAR1p110。

A-to-I的编辑倾向于发卡结构RNA结构，这个发卡可以位于外显子和内含子之间，也可以位于外显子内部。只有发卡结构才能引起ADAR1这个酶对其进行编辑。

在免疫这块研究比较多的模型是发现A-to-I能够调节I型干扰素的表达。具体机制是由ADAR1介导，当这个酶发生了突变或者缺失，就会导致双链RNA缺失掉了编辑的过程，影响到下游蛋白通路的传递，进而影响了I型干扰素的表达。

结果解读

这篇文章一共有6张大图，可以分为4部分。

Fig1中提出了一个现象 ，即Gabra3在乳腺癌中特异性高表达，这种高表达不仅仅和肿瘤发生有关，还和肿瘤转移有关。

Fig2-3做了基因功能研究 ，采用了一正一反的方法：Fig.2过表达Gabra3促进乳腺癌转移；Fig.3沉默Gabra3表达抑制乳腺癌转移。这是功能研究的标准套路。

Fig4中提出了一个新的现象 ，是关于机制的，发现Gabra3 A-to-I RNA编辑只存在于非侵袭性乳腺癌，转移性的乳腺癌会把这种现象丢失掉。

Fig5-6对机制进行深入的研究 ，方法是人为的导入一种突变型载体。发现编辑后的Gabra3蛋白能影响乳腺癌的迁移、侵袭和转移；并且编辑后能降低膜上Gabra3的表达、抑制AKT磷酸化。

具体来看，在Fig1a中检验了Gabra3在人组织中分布的差异，发现其主要在脑组织表达，胎脑表达最高。

既然是研究乳腺癌当然要拿到肿瘤组织中去检测，发现在乳腺癌中存在一种特异性的表达。肿瘤细胞包括MDA-MB-231、MDA-MB-436、MDA-MB-453、SKBR3这几个细胞株中的表达度偏高些。而在人正常上皮细胞系，HMEL里就几乎检测不到。这也说明它和肿瘤的发生存在关系。

在后面的研究中，作者选择了MCF7，因为它低表达，所以做了过表达的实验；另一株选了MDA-MB-436，因为它表达最高，所以做了RNA的实验验证。这里通过WB的检测就把模型确定了下来。

除了在细胞株的检测外，还取了5对临床样本。虽然数量不多，但确是比较珍贵的配对组织中（原发灶和转移灶）的样本。做了qPCR的检测分析，发现在病人转移灶中其表达是特异性增高（Fig1c），最高80倍。

Fig1D是一个生存曲线，看Gabra3高表达和预后生存的关系，结果表明乳腺癌中Gabra3高表达预示着生存期更短。

Fig2中对Gabra3人为的进行基因操作，使其高表达。 Fig2A发现MCF-7细胞过表达Gabra3后迁移能力显著增强。

Fig2b和Fig2a非常像，这个表明， MCF-7细胞过表达Gabra3后侵袭能力显著增强。

Fig2c进行了体内实验，MCF-7细胞过表达Gabra3促进裸鼠乳腺原位成瘤的肺转移。

Fig2做了过表达，Fig3就反了过来做高表达细胞株的基因沉默实验，这里作者选择了MDA-MB-436细胞株，做法和Fig2一样。

MDA-MB-436 细胞沉默Gabra3后细胞迁移能力降低，侵袭能力降低，抑制裸鼠乳腺原位成瘤的肺转移。

Fig4探讨了基因的进一步机制，这里先没有寻找Gabra3影响的通路，而是寻找其上游的调控机制。Fig4a-c 中的结果表明Gabra3 A-to-I 编辑与侵袭能力负相关。

Fig4d用了之前5对乳腺癌的原发灶和转移灶，发现乳腺癌转移灶组织中Gabra3 A-to-I 编辑丢失。

因为能够引起A-to-I编辑的主要是ADAR1蛋白，那到底是ADAR1p110还是ADAR1p150呢？答案是ADAR1p110参与乳腺癌中Gabra3的A-to-I 编辑。（ADAR1p150和ADAR2检测不到）

经过前面现象的提出，接下来就要人为调控A-to-I的编辑。Fig5发现通过A-to-I RNA编辑 可以抑制乳腺癌迁移、侵袭和转移。Fig5a、b中MDA-MB-436细胞导入编辑的Gabra3可抑制迁移和侵袭。

反过来在MCF-7细胞导入突变的未编辑Gabra3可显著增加迁移和侵袭（该表型可恢复）。

体外做完了，体内再重复一下，用的还是小鼠模型。MDA-MB-436细胞导入编辑的Gabra3可抑制乳腺癌肺转移。

到了Fig6，开始搞下游信号通路。作者首先做了个流式分析，看看膜表面Gabra3的表达。

Fig6a：MDA-MB-436细胞导入编辑的Gabra3降低膜表面Gabra3表达

Fig6b：MCF-7细胞导入突变的未编辑Gabra3增加膜表面Gabra3表达

Fig6c：MDA-MB-436细胞导入编辑的Gabra3降低磷酸化AKT表达

Fig6d：MCF-7细胞导入突变的未编辑Gabra3增加磷酸化AKT表达

套路分析

这里提一篇大神的Review，“Hallmarks of Cancer：The Next Generation”，里面提出了肿瘤10种典型的表型。并且针对这10种表型，提出了相应的治疗策略，为我们研究肿瘤治疗提供了靶点。

最后是酸菜总结的在肿瘤研究中的万金油套路。