DFP主要由总糖、糖醛酸和蛋白质组成，如补充表1所示。用苯酚-硫酸法测定的总糖含量为88.50%±0.89%，糖醛酸和蛋白质含量分别为4.79%±0.23%和3.86%±0.19%。与混合标准品相比，DFP主要含有Ara（0.33%）、Gal（0.31%）、Glc（19.05%）、Xyl（0.42%）和Man（79.89%）（图1A）。尺寸排阻色谱结合多角度激光散射和折射率检测（SEC-MALLS-RI）显示，DFP的数均分子量（Mn）为93.416 kDa，重均分子量为367.478 kDa（补充图1）。紫外光谱结果显示，在190至200 nm之间有一个突出的吸收峰，这是多糖的特征，在260 nm和280 nm处有两个较小的峰，表明存在痕量的蛋白质和核酸（图1B）。傅里叶变换红外光谱结果显示，在3442.10 cm ^-1 处有一个与-OH伸缩振动相对应的强宽峰，在2926.45 cm ^-1 处存在一个C-H伸缩振动峰，在1736.98 cm ^-1 和1636.80 cm ^-1 处出现两个C=O吸收峰。1433.81 cm ^-1 和1383.99 cm ^-1 处的额外峰对应于C-H弯曲振动，而C-O振动出现在1100 cm ^-1 附近。β-糖苷键的特征峰可以在878.73 cm ^-1 处观察到（图1C）。扫描电子显微镜（SEM）图像显示，DFP在低放大倍数下呈蓬松的颗粒状结构，排列相对松散。在更高的放大倍数下，DFP的结构类似于珊瑚，具有堆叠的形态（图1D）。

图1 曲茎石斛多糖（DFP）的特性研究。 （A）DFP的单糖组成。（B）DFP的紫外（UV）光谱。（C）DFP的傅里叶变换红外光谱。（D）DFP的扫描电子显微镜（SEM）图像。

体内实验过程如图2A所示。处死大鼠后，我们收集每组的组织样本，称重并拍照。胃组织形态和病理如图2B所示。对照组胃黏膜形态正常，无明显病变。相比之下，模型组的胃组织表现出充血、肿胀和其他形式的损伤迹象。阳性和DFP治疗组均显示胃黏膜肿胀和其他病理状况有所改善。为了进一步评估胃黏膜损伤，我们使用了Guth评分系统。模型组的UI得分最高，而阳性药组的改善最为显著，其次是DFP-H组（图2C）。所有阳性药组和DFP组均对酒精诱导的胃黏膜损伤具有保护作用。具体来说，阳性药组的UI抑制率为54.08%±10.25%，DFP-L组的抑制率为31.42%±12.65%，而DFP-H组的抑制效率为44.62%±10.09%。在整个实验过程中，各组大鼠的体重以相似的增长率增加，没有显著差异（图2D）。此外，各组之间的肝脏、肾脏和脾脏系数没有显著差异，表明DFP对大鼠没有明显毒性（图2E）。

图2 DFP预防酒精性胃黏膜损伤的药效学实验 。 （A）动物实验程序。（B）胃组织的代表性图像。（C）各组溃疡指数（UI）评分。（D）大鼠体重的变化。（E）大鼠肝、肾、脾指数。与对照组相比####P<0.0001，与模型组相比****P<0.0001。

HE染色进一步检测所有实验组胃黏膜组织的病理变化。如图3A所示，对照组胃黏膜细胞组织良好，组织结构清晰，管状胃腺排列有序。相比之下，模型组表现出明显的黏膜水肿、血管扩张和出血、腺体结构紊乱和上皮细胞损失。阳性组和DFP治疗组均显示出明显的改善，特别是在减少黏膜水肿和充血方面。然后我们使用酶联免疫吸附试验（ELISA）测量大鼠血清中炎性细胞因子IL-6和IL-1β炎性因子的血清水平（图3B和C）。与对照组相比，模型组显示这些细胞因子的表达显著升高，证实了胃黏膜损伤的成功诱导。与模型组相比，阳性组和DFP治疗组的IL-6和IL-1β均显著下调（P<0.05）。髓过氧化物酶（MPO）是中性粒细胞活化和炎症的标志物，在酒精暴露后，模型组胃组织中的MPO也升高，反映了炎症反应的增加。在阳性组和DFP治疗组中，其表达显著降低（图3D）。前列腺素E2（PGE2）是胃黏膜损伤的保护因子，超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽（GSH）是参与自由基清除的关键抗氧化剂，在模型组中表达降低（图3E-G）。奥美拉唑或DFP给药导致这些保护因子的表达显著增加。此外，脂质过氧化的标志物丙二醛（MDA）在模型组中上调，但在DFP或奥美拉唑干预后下调（图3H）。

图3 DFP影响炎症因子和氧化应激因子的表达 。 （A）HE染色结果。（B-D）IL-6、IL-1β和MPO的表达。（E）PGE2的表达。（F-H）SOD、GSH和MPO的表达。箭头表示上皮细胞脱落；圆圈表示黏膜充血；三角形表示血管舒张，矩形表示水肿和腺体结构紊乱。与对照组相比，##P<0.01、###P<0.001和####P<0.0001；与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

我们首先进行主成分分析（PCA）以评估各组之间的相关性。如图4A所示，PCA揭示了模型、DFP-H和对照组之间的明显分离，DFP-H与对照组紧密地聚集在一起。为了鉴定DFP调节的核心蛋白，我们进行了加权蛋白共表达网络分析（WPCNA），以探索蛋白质、炎症因子和氧化应激指标之间的关系。如图4B所示，棕色模块与PGE2、SOD和GSH呈显著正相关，与IL-6、IL-1β、MPO和MDA呈显著负相关（P<0.05）。相反，红色模块表现出相反的相关性模式，尽管这些相关性仍然显著（P<0.05）。因此，棕色和红色模块都被鉴定为由DFP调节的潜在核心蛋白。然后，我们根据|Log2倍数变化|>1.5和P<0.05的标准筛选差异表达的蛋白质。火山图（图4C）显示，与对照组相比，模型组中有406种上调的蛋白质，包括AGT、FGB和SERPIND 1，116种下调的蛋白质。与模型组相比，DFP-H组显示74种上调蛋白和247种下调蛋白，包括AGT和MASP2（图4D）。维恩图进一步确定了红色模块的84个共同点和与棕色模块相关的10个蛋白质（图4E）。这94种核心蛋白的热图显示在补充图2中。为了研究蛋白质相互作用（PPIs），我们利用STRING数据库，并使用Cytoscape 3.9.1将蛋白质分为三个不同的组：绿色、紫色和橙色（图4F）。绿色簇包含18种差异表达的蛋白质。使用cytoHubba插件，我们通过MCC方法鉴定了前20个核心蛋白（图4G），圆圈越大，得分越高。大多数核心蛋白聚集在绿色和紫色簇中，如FGB、FGA、SERPIND 1和CPB2。FGB和FGA参与凝血和炎症，SERPIND1作为凝血抑制剂，CPB2参与纤溶并调节炎症反应。这些蛋白质与炎症和凝血密切相关。对94种候选蛋白和前20种差异表达蛋白的KEGG通路富集分析表明，补体和凝血级联是主要的重叠通路（P<0.05）（图4H和I）。

图4 DFP在预防酒精诱导的胃黏膜损伤中的综合蛋白质组学分析 。 （A）主成分分析（PCA）结果。（B）WPCNA分析。（C）对照组和模型组之间差异蛋白质的火山图。（D）模型和DFP-H组之间差异蛋白质的火山图。（E）Venny图。（F）由94种蛋白质组成的PPI网络。（G）来自cytoHubba分析的前20种蛋白质。（H）对照组和模型组的KEGG富集结果。（I）模型和DFP-H组的KEGG富集结果。

为了阐明DFP对血清代谢物的影响，我们进行了一项广泛靶向的代谢组学研究。正离子和负离子的总离子色谱图分别如补充图3A和B所示。我们采用正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）来识别各组之间的差异代谢物。如图5A所示，我们观察到对照组和模型组之间存在明显的分离。200次置换检验的结果（R ² Y=0.999，Q ² =0.82）证实了模型的可靠性和预测能力（图5B）。然后，我们使用VIP>1和P<0.05的阈值鉴定差异代谢物。与对照组相比，我们在模型组中鉴定出147种上调和57种下调的血清代谢物（图5C）。同样，图5D和E显示，DFP-H和模型组是可区分的，模型具有中等水平的可靠性（R ² Y=0.998，Q ² =0.433）。与模型组相比，我们在DFP-H组发现26种上调和17种下调的血清代谢物（图5F）。维恩图突出显示了13种差异代谢物，这些代谢物在所有组中表现出一致的表达模式（图5G）。这13种代谢物在对照组、模型组和DFP-H组中的表达热图如图5H所示，详细化合物列于补充表2中。通路富集分析确定“丙酸代谢”是与DFP对酒精诱导胃黏膜损伤的保护作用相关的关键代谢途径（图5I）。前20个靶点和13种差异代谢物之间的相关性分析显示了很强的相关性（图5J）。例如，A2M和SERPIND1等关键蛋白与甲基丙二酸（MEDN0335）和N-肉豆蔻酰甘氨酸（MEDN1861）等代谢产物显示出显著的相关性，进一步验证了多组学发现。

图5 DFP对酒精性胃黏膜损伤的预保护作用的血清代谢组学分析 。 （A）比较对照组和模型组的OPLS-DA图。（B）对照组和模型组的置换试验结果。（C）对照组和模型组之间差异代谢物的火山图。（D）比较模型组和DFP-H组的OPLS-DA图。（E）模型组和DFP-H组的置换试验结果。（F）模型组和DFP-H组之间差异代谢物的火山图。（G）交叉差异代谢物的Venny图。（H）13种不同代谢物的热图。（I）KEGG途径差异代谢物富集分析。（J）差异代谢物与核心蛋白的相关性分析。

一项全面的多组学分析强调了补体和凝血级联信号通路是DFP对酒精诱导的胃黏膜损伤的预保护作用的关键机制。免疫组织化学分析显示，与对照组相比，模型组中补体C3和VTN的表达升高，DFP处理后表达水平下降（图6）。此外，我们还检测了凝血相关因子，包括THRB、Serpind1、FGA、CPB2及其下游蛋白VWF。免疫组织化学进一步证明，DFP显著下调了胃黏膜损伤大鼠中这些蛋白质的表达（图6）。PAS染色表明，DFP增加了损伤大鼠胃上皮细胞中粘性物质的分泌（图7A）。荧光染色结果表明，与模型组相比，DFP显著增强了胃黏膜中紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的荧光强度（图7B-C）。这些发现表明，DFP增强了对受损胃黏膜的保护作用。

图6 DFP对酒精诱导的胃黏膜损伤保护作用的关键蛋白的免疫组织化学分析

图7 DFP对胃上皮屏障完整性的影响。 （A）胃组织PAS染色。（B）ZO-1和Occludin的免疫荧光分析。（C）ZO-1和Occludin荧光强度的定量。与对照组相比，#P<0.05；与模型组相比，*P<0.05。

随着生活水平的提高，胃相关疾病的发病率显著增加。在促成因素中，过量饮酒已成为主要原因。当酒精进入胃时，它会刺激胃黏膜，增加胃酸分泌，破坏黏膜屏障。目前对胃黏膜损伤的理解表明，它主要是由外部侵袭因素和身体内部保护机制之间的不平衡引起的。这突显了医疗界对能够保护胃肠道并维持身体稳态的天然化合物的迫切需求。现代药理学研究强调，多糖具有多种有益活性，包括抗炎和增强免疫作用。铁皮石斛、金钗石斛和霍山石斛多糖对胃肠道的保护作用已被广泛研究，表明它们具有减轻胃黏膜损伤的潜力。相比之下，DF是一种主要分布在中国中部山区的特有植物，目前科学界对其成分和药理作用的研究较少。本研究首次采用多组学技术探讨DFP对酒精性胃黏膜损伤的影响及其机制。本研究的工作流程如图8所示。

本研究进行的药效学实验表明，DFP降低了MPO和炎性细胞因子（包括IL-6和IL-1β）的表达。此外，DFP下调了氧化应激标志物（如MDA、GSH和SOD）的表达，同时上调了保护因子PGE2的表达。为了研究DFP对乙醇诱导的胃黏膜损伤的预保护作用的潜在机制，我们使用蛋白质组学来鉴定DFP给药前后差异表达的蛋白质。鉴于大量差异表达的蛋白质，我们使用WPCNA和蛋白质相互作用分析来进一步鉴定与DFP治疗相关的关键蛋白质。我们发现棕色和红色模块与保护和炎症因子密切相关。值得注意的是，我们鉴定出20种核心蛋白，包括Sepind1，主要富集在补体和凝血级联信号通路中。补体系统是先天免疫系统的重要组成部分，由在免疫防御中起关键作用的蛋白质组成。C3和C5是该系统的重要组成部分，当发生炎症反应时，它们会被激活。研究表明，幽门螺杆菌胃炎患者胃上皮细胞中的C3补体激活。DFP干预后，乙醇诱导的胃黏膜损伤大鼠C3和C5的表达显著降低。 ‌ VTN是一种多功能糖蛋白，通过中和MAC自身反应来调节MAC的形成并维持体内平衡。研究表明，VTN/αv整合素可介导小鼠骨髓巨噬细胞NF-κB活化并诱导炎症因子表达，将VTN表达与炎症联系起来。在本研究中，DFP显著降低了胃黏膜损伤大鼠VTN的表达，从而降低了炎症反应。

身体的凝血系统包括凝血、抗凝和纤溶系统；保持这三个组成部分之间的动态平衡对于调节血流和防止失血至关重要。在乙醇诱导的大鼠胃黏膜损伤模型中，大量炎症因子被释放，导致器官内皮损伤，并导致大量von VWF的释放。VWF是血小板和内皮细胞之间的关键配体，可增强血小板在微循环中的粘附和聚集。此外，CPB2蛋白通过从生物活性肽和蛋白质中去除C末端赖氨酸残基，在纤溶中起着至关重要的作用。同时，凝血酶原（THRB）的激活加速了凝血酶的产生，并增加了纤维蛋白原FGA的表达。由于稳态失衡，SERPIND1和A2M等抗凝因子持续表达。研究表明，A2M可以直接与IL-1β结合，从而下调NF-kB通路介导的促炎反应。在这项研究中，DFP被证明可以减少大鼠胃组织的充血和发红。免疫组织化学分析证实，DFP显著下调C3、VTN和THRB等关键蛋白的表达，从而减轻胃黏膜损伤。这项研究首次报道了DFP调节补体和凝血信号通路以预防乙醇诱导的胃黏膜损伤的潜在预保护机制，这与其他石斛属物种的报道不同。其他研究者发现铁皮石斛多糖可以改善醋酸诱导的大鼠胃溃疡。Elisa、qPCR等方法进一步证明铁皮石斛多糖可以通过减少氧化应激和炎症反应来改善大鼠胃溃疡。霍山石斛多糖也被报道能够通过调节Nrf2信号通路来缓解氧化应激和炎症，从而改善酒精诱导的大鼠胃黏膜损伤。

多糖是高分子量化合物。研究表明，石斛多糖在胃肠道中被部分消化，大部分未消化的多糖被末端小肠吸收，随后被肠道微生物群降解为四种促进健康的短链脂肪酸。尽管这项研究没有关注胃肠道菌群，但对DFP胃黏膜损伤有抵抗力的大鼠的血清代谢组学数据在丙酸代谢途径中得到了富集。该途径涉及许多不同的代谢产物，如琥珀酸和甲基丙二酸。琥珀酸是TCA的中间体，与各种炎症性疾病有关。我们在克罗恩病患者中观察到血清琥珀酸水平升高和SUCNR1表达增加，SUCNR1在小鼠肠道炎症和纤维化中起着重要作用。因此，调节琥珀酸水平可能有助于维持身体的稳态。甲基丙二酸是丙酸代谢途径的产物，也是维生素B12缺乏症的临床生物标志物，也可以与SUCNR1结合，并与上皮间质转化、纤维化和炎症等疾病有关。丙酸是一种重要的SCFA成分，可以在右旋糖酐硫酸钠结肠炎模型中诱导再生胰岛衍生蛋白3型（Reg3）的产生。Reg3-丙酸轴可能对结肠炎期间的肠上皮再生至关重要。丙酸代谢，以及琥珀酸和甲基丙二酸的代谢，在调节炎症和氧化应激中起着关键作用。在酒精诱导的胃黏膜损伤大鼠中，DFP干预前后这些代谢物的显著变化表明，DFP可能通过调节丙酸代谢提供预保护作用。总之，DFP对酒精诱导的胃黏膜损伤的保护机制涉及多个靶点、途径和代谢物的调节，它们共同作用修复和加强胃黏膜屏障，同时减少炎症。这种机制与奥美拉唑形成鲜明对比，奥美拉唑是一种广泛用于治疗胃黏膜损伤的药物。奥美拉唑主要通过作为质子泵抑制剂抑制胃酸分泌来缓解胃酸诱导的刺激。奥美拉唑通过抑制胃壁细胞中的H ⁺ /K ⁺ ATP酶，减少胃酸的产生，从而减轻炎症并防止进一步的黏膜损伤。此外，通过减少胃酸刺激，奥美拉唑有助于恢复胃黏膜屏障，减少炎症反应，促进溃疡愈合。

基于这些结果，我们计划对这些差异表达的蛋白质和代谢物进行详细分析，探索DFP通过调节其表达发挥对乙醇诱导的胃黏膜损伤的保护作用。这将有助于我们构建更清晰的DFP核心蛋白核心代谢产物网络，全面了解DFP对乙醇诱导的胃黏膜损伤的预保护机制。不可否认，这项研究将促进DF的利用，从而促进其种植。

本研究全面探讨了DFP对酒精性胃黏膜损伤的预保护作用及其潜在机制。首先，提取并表征DFP，然后进行药效学实验，证明其在减少炎症因子和氧化应激方面的功效，同时缓解酒精诱导的胃黏膜损伤大鼠的胃组织充血、发红和肿胀。蛋白质组学和WPCNA分析进一步表明，DFP调节补体和凝血级联信号通路，降低核心蛋白如补体C3、VTN、Serpind1、CPB2和THRB的表达。此外，琥珀酸和甲基丙二酸是DFP给药前后的关键差异代谢物，这些代谢物主要参与丙酸代谢途径。总之，药效学、蛋白质组学和代谢组学数据的组合多组学分析为DFP对酒精诱导的胃黏膜损伤的预保护作用和机制提供了重要见解，为DFP资源的保护和未来的应用提供了基础。