本期内容主要有空间通讯分析原理（2个软件）、结果展示及应用思路。
物理接近性：
通过识别物理上接近的细胞对，来推断它们之间的生物学交互作用。这是基于最大可能的分子相互作用/扩散范围来确定的。
扩散距离：
分子在空间组织中的扩散距离取决于多种因素，例如分子大小、共价修饰、空间组织的密度以及细胞膜和细胞外环境中的调节因子。这些因素通常会减少分子的扩散距离。
理想扩散范围：
在CellChat软件中，使用在自由介质中的理想扩散范围（默认250 μm）来确保不会排除任何空间上可能的相互作用。
接触依赖性信号：
对于接触依赖性的信号传递（数据库中选择“Cell-Cell Contact”子集），交互范围限制在每个细胞的最近邻居之间，以确保信号传递和靶细胞直接接触。
（1）
指定切片样本和目标亚群：
选择欲做空间通讯分析的切片样本，由于要计算同一张切片内亚群之间的物理距离，所以一次分析任务只能选择一张切片进行分析，然后使用切片上所有的亚群进行该分析，或者挑选切片中的目标亚群进行该分析，主要根据研究目的进行选择。
（2）数据预处理：
基于空间转录组数据的亚群筛选高变基因集，主要是去除噪音。
（3）识别物理接近的细胞对：
基于spots的空间位置计算物理距离，识别物理上接近的spots对。
（4）确定扩散范围：
根据分子特性和空间组织的特性，确定分子的扩散范围。软件默认250 μm，它就表示最大的互作距离。
（5）空间通讯分析类型：
在确定的扩散范围内，推断spots之间的互作关系，分为两大类型，分别计算它们的互作关系：
①
分子相互作用：
识别在物理接近范围内可能发生的分子相互作用。选择CellChatDB中的“分泌蛋白信号、细胞外基质-受体、非蛋白配体的互作”子集。通过预先设置的最大互作距离来分析。
②
接触依赖性信号：
识
别直接接触的细胞对之间的信号传递。选择CellChatDB中的“细胞间接触“子集。通过预先设置的spots间接触距离来分析。
图1 CellChatDB的4种子集，其中第3个是接触依赖性信号
（6）
计算空间通讯互作：
需要同时满足最大互作距离、邻近细胞对的数量、L-R共表达的条件。
① 首先根据扩散范围和物理距离判断两两spots是否满足最大互作距离；spots对的距离 ＜ 最大互作距离参数，表示spots对邻近，符合分子的空间扩散距离；spots对的距离 = spots间接触的距离，表示spots对是接触的关系，符合接触依赖性信号的分析距离；spots对的距离＞最大互作距离参数，表示spots对距离太远，不能互作。
② 统计两亚群中邻近的spots对数量，这个也需要满足预设阈值，默认为10，表示两个亚群中有10对spots是邻近关系，那就说明这两个亚群在空间距离上是邻近关系；
③ 计算空间距离邻近的两两亚群内的配受体互作强度，这个就与单细胞通讯分析一样了，没有满足空间邻近关系的两两亚群不再计算配受体基因对的互作强度。
④ 通过置换检验识别两两亚群的显著配受体对。（默认pvalue＜0.05）
目前空间转录组技术有不同的试剂（10X、华大等），还有不同的分辨率，所以这些技术的差异也会影响不同参数设置。主要有两个关键的参数：
（1）
最大互作距离参数
。该参数最大不能超过切片的捕获区域大小，否则失去空间物理距离的计算意义，更确切的说，不能超过切片捕获区域的一半大小，该值太大都会失去空间转录组分析的意义。
（2）
spots间接触距离参数
。该参数需要提供像素与距离的比例尺才能满足spot-spot之间接触距离的分析内容。
①10X Visium需要提供分辨率，如100 μm、8 μm、16μm，即参数contact. range=100。
②华大Stereo-seq需要提供bin策略和bin值大小，例如使用Square bin策略的bin50，那么spots间的接触距离就是25 μm，即参数contact. range = 25。
邻近细胞类型的优先交互：
CellphoneDB会优先考虑发生在邻近细胞类型之间的相互作用。
限制交互细胞类型对：
工具会限制细胞类型的交互对，仅分析那些共存于同一微环境中的细胞类型组合。
（1）
主观定义可能存在互作的亚群对：
CellphoneDB使用这些空间信息来定义可能的细胞交互对，即那些在同一微环境中共定位的细胞类型对。
① 组织形态学观察
③ 去卷积查看细胞类型分布，从而发现微环境中的目标亚群
（2）
微环境信息的提供：
整理微环境文件表格，赋值给microenvs参数。这个文件包含两列，指示哪种亚群名称（第一列）位于哪个切片中（第二列）。microenvs = test_microenvs.txt
（3）其他分析过程与单细胞
CellphoneDB
通讯分析一样。
在空间转录组通讯分析中，相比于单细胞而言，我们通过物理距离可以避免很多假阳性的细胞互作对，从而获得更全面的信息、更准确地描绘细胞亚群的分布和相互作用，系统性解码细胞间的通信网络，有助于揭示通讯细胞间的调控机制。
通过细胞亚群互作关系分析挑选出关键的细胞对后，我们进行挑选关键细胞对中的关键的配受体基因对，从而研究关键细胞对的通讯关系是由哪些配受体对的基因主导调控，进一步实现从细胞互作到分子调控机制的研究。
通过空间转录组的物理距离，计算与每个信号通路相关的所有配体-受体相互作用的通信概率来推断信号通路水平上的通信概率，查看不同通路的配受体信号强弱，以此分析生物学功能在细胞通讯作用下的活性变化趋势，筛选出由通路介导的关键细胞对互作。
通过组间切片样本分别进行空间通讯分析后，比较细胞亚群通讯的强弱变化，还可以将细胞通讯的强弱变化与样本表型结合在一起，更有利于解释细胞互作与生物学意义之间的关联，以获得与生物学问题更准确、更相关的细胞调控关系。
