乳酸化或者乳酰化，应该是最近几年比较热门的研究方向。今天看的这篇文章，就是华中科技大学同济医学院附属同济医院的博士生，发表在14.3分的Adv Sci (Weinh)上的乳酰化研究，他们研究的这个蛋白又和RNA的m6A甲基化有关，这一层层的调控还是挺有意思的，我们就一起来看看吧：
他们研究的方向，其实是代谢的重编程与耐药之间的关联性。所以他们选择了HCC（肝细胞癌）的一个乐伐替尼耐药株，进行了多组学分析，蛋白组学和转录组学都显示，耐药组中糖酵解途径相关的基因有了明显的增加（通过组学的方法，来进行分析，其实就是通过归纳法来进行了差异的总结，也就是米勒五法的求同求异法，不熟悉米勒五法的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》和《列文虎克读文献》）。糖酵解的产物，也就是乳酸的增多，可能会导致蛋白的翻译后修饰。于是他们又查看了耐药组中蛋白的乳酰化水平。而使用了糖酵解抑制剂2-DG（2-脱氧-D-葡萄糖），可以阻遏蛋白的Pan-KLac（泛赖氨酸乳酰化）水平，也增加了细胞的凋亡。也就是说，乐伐替尼耐药的HCC细胞系，表现出升高的乳酰化水平：
在乳酰化上调最多的蛋白中，有一个比较突出的蛋白，就是IGF2BP3，这个蛋白又是一个m6A甲基化的Reader。这可能就是一个有意思的切入点，于是他们就着手开始研究IGF2BP3的乳酰化。通过液相色谱-质谱联用，他们找到了IGF2BP3的具体乳酰化位点，就是第76位赖氨酸这个位置，也就是K76。为了确定IGF2BP3的K76乳酰化的作用，他们敲减了IGF2BP3之后，分别过表达了野生型的IGF2BP3和IGF2BP3的K76R突变体（这里就是将IGF2BP3的乳酰化位点进行突变，使之无法乳酰化，这样命题的外延，就是IGF2BP3的K76乳酰化，而不是IGF2BP3的表达情况，有效避免了肯定后件的逻辑谬误，不清楚命题的内涵和外延，以及肯定后件逻辑谬误的话，可以看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列）。结果发现，IGF2BP3的K76乳酰化，在体内外都赋予了HCC细胞的乐伐替尼耐药性：
那么IGF2BP3的K76乳酰化直接影响的下游又是什么呢？他们接着推进课题，通过RIP-Seq（RNA免疫沉淀测序）他们找到了能与IGF2BP3结合的mRNA，PCK2、NRF2和AKNA。这几个基因的mRNA表达差异，也在测序数据中得到了体现。同时分别敲减PCK2或NRF2，都能提高HCC的乐伐替尼耐药性。PCK2是糖异生过程中的关键酶，调节氧化还原稳态。于是他们假设IGF2BP3可以通过K76乳酰化（假设的迭代，就是通过各种已知的结果，将原有的假设进行进一步的迭代，在这里通过分析了IGF2BP3的靶基因，通过PCK2和原有的代谢重编程联系了起来，实现了假设的迭代，不清楚假设和假设迭代的话，可以去看看《科研的推理和逻辑：从实验台到咖啡桌》、《列文虎克读文献》和《信号通路是什么鬼？》系列），影响氧化还原稳态。与IGF2BP3的K76R突变体类似，敲除了PKC2可以恢复IGF2BP3野生型造成的抗氧化，增加了ROS：
那么IGF2BP3对于PCK2或NRF2的影响，是否是由于其m6A甲基化Reader的功能导致的呢？转录组分析发现，m6A甲基转移酶METTL3、METTL14和WTAP在耐药细胞中表现出RNA水平升高，而敲减了METTL3会导致PCK2和NRF2的表达降低。而突变了PCK2和NRF2的m6A甲基化位点，也能影响IGF2BP3对其结合。这就说明IGF2BP3对PCK2和NRF2的表达调控，是依赖于m6A甲基化的。那在这个过程中，IGF2BP3的K76乳酰化又起到了什么功能呢？大多数的PTM（翻译后修饰）都可能会影响蛋白功能，于是他们假设IGF2BP3的K76乳酰化可能会影响其m6A甲基化Reader的功能。而结果显示，IGF2BP3的K76乳酰化，的确能增强其对乐伐替尼耐药性细胞中的m6A修饰的RNA的捕获：
对乐伐替尼耐药细胞的转录组分析后发现，在耐药组中，甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢的显着富集。而PCK2作为糖异生的关键酶，为丝氨酸合成提供底物。研究发现，IGF2BP3的K76乳酰化可以调节丝氨酸生物合成，从而增强耐药细胞的抗氧化能力并促进乐伐替尼的耐药：
丝氨酸合成的增加，可能会增强一碳代谢途径，从而诱导SAM的产生，SAM是整体甲基化的关键甲基供体。通过假设迭代，他们又把促进m6A甲基化这个过程，作为了IGF2BP3的K76乳酰化的下游，形成了一个对PCK2的正反馈途径（正反馈和负反馈的话，这个在PI3K-AKT信号通路和mTOR信号通路以及NFκB信号通路中其实也讲过，这三个通路分别介导了正反馈和负反馈，有兴趣的话，可以回去看看《信号通路是什么鬼？》系列）SAM的上调取决于PCK2表达，而IGF2BP3的K76乳酰化促进了m6A甲基化修饰的PCK2表达，SAM的上调又促进了PCK2的m6A甲基化，这就形成了一个正反馈：
IGF2BP3的K76乳酰化促进了PCK2的表达，同时也促进了SAM的产生。而增加的SAM，又能促进m6A甲基化，从而促进另一个抗氧化基因NRF2的m6A甲基化，又进一步通过IGF2BP3促进了NRF2的表达（NRF2这是个经典的抗氧化相关的转录因子，如果你们还记得铁死亡的调控的话，应该还对p62、Keap1和NRF2对于抗铁死亡过程的调控有印象，不清楚的话，可以去看看《信号通路是什么鬼？》系列的铁死亡那几章复习下）。而IGF2BP3的K76乳酰化/PCK2/SAM轴，也是通过m6A甲基化进了NRF2在乐伐替尼耐药的HCC中的表达：
既然IGF2BP3的K76乳酰化，对于HCC的乐伐替尼耐药，有这么大的作用。那临床上是否具有相关性呢？通过对临床数据的分析，他们发现高IGF2BP3乳酰化水平，与对HCC的乐伐替尼的治疗反应不佳相关。而使用糖酵解抑制剂（抑制乳酸产生），或者使用siIGF2BP3负载的脂质纳米颗粒，靶向IGF2BP3可恢复HCC中的乐伐替尼敏感性：
这篇文章其实是一篇蛮有意思的课题，他们通过糖酵解增加，及其产物乳酸的增多，分析了蛋白的乳酰化。又通过IGF2BP3的K76乳酰化，确定了靶基因，及其与SAM相关的m6A甲基化的关联性，形成了一个正反馈通路：
工作量上，这篇文章也是相当大的。而且在研究的过程中，基本上也遵循了科研推理的必要过程，通过较为严谨的实验设计，完成了这个课题，是一篇蛮不错的文章。好了，今天就先策到这里吧，有兴趣的话，可以看看原文，祝你们心明眼亮。
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