手把手教学｜流式细胞术检测细胞凋亡

实验老司机 · 公众号 · · 2024-10-19 07:00

正文

流式细胞术检测细胞凋亡的大致原理为：一般情况下是采用两种染料PI和Annexin V对细胞进行染色，Annexin V可选择性结合磷脂酰丝氨酸，从而检测细胞的早期凋亡，而PI可以染坏死和晚期凋亡的细胞，两种染料联合使用从而对细胞凋亡进行检测。

实验步骤：

1)细胞铺板：流式凋亡检测常用6孔板铺细胞，初始密度由实验要求决定，常规细胞铺板后密度达到要求即可收细胞，收细胞时应选择在细胞状态最好的时候进行。

2)开始收细胞前准备好冰浴的PBS缓冲液。

3)收集细胞时，吸出原培养基暂存离心管内，每孔加入500μl不含EDTA的胰酶消化细胞，时间由细胞本身决定，和正常消化细胞时间相近即可，期间注意观察细胞状态，消化时间不宜过长，防止出现假阳性，加入收集的原培养基终止消化，将细胞全部吹下收集到离心管内，离心机室温1000g离心5min。

4)弃上清后加入1ml预冷的PBS缓冲液重悬细胞，并转移到1.5ml离心管内，离心机4℃、300g离心5min。

5)弃上清，加入500μl冰浴的PBS缓冲液洗涤细胞两次，每次均4℃、300g离心5min。

6)凋亡实验设计需4个分组，包括空白管：只有细胞；PI单染管：细胞+10μl PI；Annexin V单染管：细胞+5μl Annexin V；实验组：PI+Annexin V+细胞组。

7)在只有阴性对照的细胞中加入100μl PBS重悬后进行细胞计数，保证细胞量大约为1-5´10 ⁵ 个，剩余组均加100μl PBS重悬后按要求加入相应染液，避光室温反应10-15min。

8)每组加入400μl 1´Binding buffer，混匀后置冰上暂存，1h内上流式细胞仪检测，保存数据备用。

注意事项 ：

1)在细胞铺板前应规划好整个实验，铺几孔、密度等均应提前计算。

2)若铺板细胞需要转染，应按之前转染经验在一定天数后收细胞，防止时间过短转染未成功，转染时间过长细胞状态不佳。

3)在整个实验过程中，混匀细胞或吹打细胞动作应轻柔小心，防止出现过多的细胞碎片，影响实验结果。

4)完成染色后应尽快上机完成检测，时间过久会导致凋亡细胞增加，影响实验结果。

5)流式细胞仪检测时应选择合适的圈门，后续若需要自己分析结果，在flowjo中正确调节荧光补偿。

6) P I和 Annexin V均为光敏染料，实验过程全程注意避光操作，同时试剂也应避光保存。

本文作者是"呜哇呜"同学，在获得授权后，实验老司机将本文发表于公众号。

本文由作者根据自身经验总结而成，内容仅供参考。

文稿：呜哇呜

校对：煲仔饭

素材：

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