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Sci Adv | 聂舟团队开发CRISPR-Cas自催化反馈放大网络用于超灵敏DNA诊断

BioArt · 公众号 · 生物 · 2021-01-31 10:19

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责编 | 酶美

人工生化回路（Artificial Biochemical Circuit）能够精确地控制化学反应网络的动态和功能，在生物传感、生物调控和生物工程领域有着广阔的应用前景。由于核酸碱基配对具有可编程性以及核酸相关酶的多样性，核酸成为一种构建人工生物反应回路的理想单元，相关研究引起了研究者们极大兴趣。其中，杂交链式反应（HCR）、催化发夹组装（CHA）、PEN DNA回路等催化核酸回路集成级联或循环反应，在等温的条件下识别输入信号产生倍增信号输出，在床旁诊断和现场快速检测等方面显示了巨大的应用潜力。但是，这些催化核酸回路应用于实际样品时面临两个亟待解决的问题：（1）它们仅能识别单链核酸，无法直接识别基因组双链DNA靶标；（2）检测灵敏度通常在pM到fM浓度数量级，难以满足分子诊断的需求。因此，构建一种能直接检测基因组DNA靶标的超灵敏人工催化回路将极大地推进核酸回路在分子诊断领域的应用。

在过去十年间，来源于细菌的获得性免疫系统的CRISPR-Cas系统已经成为革命性的基因编辑和调控工具。近年来，合成生物学家对于构建基于CRISPR-Cas的基因回路兴趣日渐浓厚，但是其在人工催化核酸回路中的应用潜力还有待开发。Cas蛋白具有RNA介导的基因组双链DNA精准识别能力，这使得CRISPR/Cas系统有可能成为催化核酸回路中理想的基因组DNA识别模块。此外，Cas12、Cas14和Cas13等II类V型和VI型Cas蛋白具有目标识别激活的附属切割活性，有可能用于构建核酸回路中高效的催化信号放大器。

2021年1月27日，湖南大学化学化工学院聂舟教授团队及其合作者在Science Advances上在线发表题为“A CRISPR-Cas Autocatalysis-Driven Feedback Amplification Network for Supersensitive DNA Diagnostics”的论文。该团队构建一种名为“CONAN”（CRISPR-Cas-Only Amplification Network）的CRISPR-Cas12a自催化核酸正反馈网络，利用CRISPR-Cas驱动的人工核酸回路实现了临床样品中基因组核酸靶标的超灵敏和高特异性检测。

在这项研究中，团队受生物信号通路及化学反应网络的启发，综合利用CRISPR-Cas12a系统精准序列识别特性及附属切割催化活性，构建了具有指数级信号放大能力的CRISPR-Cas12a自催化核酸正反馈网路（即CONAN）。如图1所示，CONAN由信号转换器T1、信号放大器A和信号转换器T2组成，其中A和T2并联形成正反馈回路。T1（Cas12a/gRNA-T复合物）能识别基因组DNA靶标并激活Cas12a的附属切割活性；激活的Cas12a作为A（scgRNA，具有信号报道功能的可激活gRNA）的输入，切割scgRNA产生荧光信号并生成新的gRNA；新生成的gRNA经过T2（由Cas12a蛋白和辅助aDNA组成）转换成一个新激活的Cas12a蛋白；这样A与T2之间形成正反馈循环，使得每次Cas12a的附属切割行为不仅产生荧光输出，还生成一个新的有活性的Cas12a酶，实现自催化放大，同时产生的荧光信号以指数形式累积。该方法成功将Cas12a的附属切割活性的线性信号扩增转化成指数级信号放大，从而实现对基因组DNA的超灵敏检测。

图1 CONAN的工作原理及关键模块。

在该论文中，作者首先选取膀胱癌高度相关的PIK3CA基因突变体（1633G>A）为靶标验证CONAN的可行性。以人工合成的PIK3CA基因突变体为例，CONAN的荧光信号呈指数方式累积，最低可检测浓度为5 aM的靶标，相较于单独Cas12a酶检测法的检测限降低了6个数量级（图2A）。由于正反馈过程中的信号差异累积效应，CONAN显著提高了CRISPR-Cas12a系统对基因组DNA的单核苷酸突变的敏感性，尤其是提高了对间隔区邻近基序（PAM）远端错配的敏感性（图2B）。随后，该团队将CONAN分别应用于病人血清样本中乙型肝炎病毒感染情况和膀胱癌病人样本中PIK3CA基因单核苷酸突变的检测，其检测结果与qRT-PCR、NGS测序等金标方法的结果具有很好的一致性（图2C和D），显示了良好的临床分子诊断应用前景。

图2 （A）CONAN的信号响应动力学及其对目标物的响应曲线；（B）CONAN对单碱基错配的敏感性；CONAN应用于（C）血清样本中乙型肝炎病毒感染和（D）膀胱癌相关单核苷酸突变的检测。

综上所述，该工作将CRISPR-Cas系统与人工化学反应网络相耦合，构建了能够直接检测基因组双链DNA的高灵敏、高特异性的催化核酸信号放大网络，为推进核酸回路在实际分子诊断中的应用提供了一种切实可行策略。当前基于CRISPR-Cas系统的分子诊断技术已成为核酸分子诊断领域的前沿技术，例如SHERLOCK、DETECTR、HOLMES等，这些方法将核酸扩增技术（如RPA，PCR，LAMP等）与CRISPR-Cas附属切割活性相结合来实现aM级的超灵敏检测。该研究所发展的CONAN方法与传统CRISPR-Cas核酸分子诊断方法相比，无需结合额外的核酸扩增技术，仅仅依靠CRISPR-Cas系统自身实现了超灵敏核酸检测，大大降低了检测系统的复杂性。同时，该方法还具有操作简便、一步反应、室温扩增、实时检测等特点，在基因筛查、传染病防治、重大疾病的早期诊断和治疗方面展现出巨大的应用潜力。

原文链接

https://advances.sciencemag.org/lookup/doi/10.1126/sciadv.eabc7802

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