原文：Evolution and functional divergence of glycosyltransferase genes shaped the quality and cold tolerance of tea plants关键词：糖基转移酶，UGT 基因家族，基因扩张与收缩，功能分化，品质，耐寒性，自然选择，人工选择摘要：植物尿苷二磷酸（UDP）依赖型糖基转移酶（UGTs）在植物生长和代谢中发挥关键作用。本文研究了从早期藻类到被子植物的 28 个已完成全基因组测序物种中 UGT 的进化过程。研究结果揭示了茶树中 G 组和 H 组 UGT 分别存在显著的扩张和收缩现象。全基因组复制和串联重复事件共同推动了 UGT 的大规模扩张，并且自然选择和人工选择的相互作用导致了中国种茶树群体 G 组内显著的功能分化。在 G 组的 Cluster II 中，UGT 编码的酶在底物选择（如脱落酸）上的差异导致了其功能多样化，这些基因分别通过不同的正负调控模式影响茶树对低温和干旱等非生物胁迫的耐受性。G 组 Cluster III 中的 UGT 对香气底物具有多样的偏好，这为中国种茶树群体贡献了多样的香气谱。Cluster III 中的所有基因对低温胁迫均有响应，然而，受人工选择影响的 Cluster III - 1 中的 UGT 对干旱无响应。这表明茶树的人工选择主要集中于以提高品质和耐寒性为首要目标。（注*：UDP 作为糖基供体，在糖基转移酶的催化作用下，将糖基转移到特定的小分子受体上，这个过程称为糖基化。糖基化修饰广泛存在于生物体内，对许多生物分子如蛋白质、脂质、次级代谢产物等进行修饰，从而改变它们的生物活性、稳定性、溶解性以及在细胞内和细胞间的运输和定位等性质。）如果觉得对你有帮助的话，记得点赞，点个在看，这对我真的很重要
茶树主要栽培品种分为中国种（CSS）和阿萨姆种（CSA），CSS 叶小、耐寒，多为灌木或半灌木，适合高纬度地区种植，常用于制作高品质绿茶，约占中国茶树品种的 67%；CSA 叶大、较不耐寒，多为乔木或半乔木，主要生长在热带地区，常用于制作红茶。茶树是重要的经济作物，富含次生代谢产物，具有重要药用价值和文化意义，其分布广泛、生态系统稳定、品质参数稳定且经济寿命长，是研究环境变化对陆生植物影响的理想多年生模式植物。糖基化促进次生代谢物的运输和积累。植物中天然色素、激素、香气和风味物质常以糖苷的形式积累。大部分糖苷是次生代谢产物的生物活性衍生物，前期研究表明，UGT亚家族的底物特异性和活性各不相同，间接促成了糖基化在植物中丰富多样的生理功能。但仅从基因组水平推断茶树中 UGT 的扩增，尚缺乏确凿的证据来解释UGT扩增与茶树品质和抗逆性的关系。本研究从全基因组水平分析 UGT 在茶树中的扩张机制，包括基因复制事件、表达模式和生物学功能等，以深入探究 UGT 在茶树中的进化和功能多样性，以及其在茶树应对环境胁迫中的作用机制。 本研究可看作高级的基因家族分析文章，大家可重点学习研究和行文思路！
为了解 UGT 在植物中的进化轨迹，对 28 种代表性植物（涵盖从早期藻类到被子植物）进行系统发育分析。结果显示 UGT 在植物界广泛分布且经历显著扩张，确定了 5 个关键系统发育组（A、D、E、G、L）在被子植物进化历程中显著扩张。茶树中检测到 297 个 UGT 拷贝，上述 5 个组扩张比例大于 1，其中 G 组拷贝数较多，而在模型植物拟南芥中为第二大组的 H 组（UGT76）在茶树中仅存在一个拷贝，表明茶树中 UGT 存在显著的谱系特异性扩张和收缩现象。
为了探究茶树品种间 UGTs 进化的差异，对不同茶树品种（野生茶树 DASZ、CSA 栽培茶树 YK10 及 CSS 栽培茶树如 Shuchazao（SCZ）、Longjing43（LJ43）、Tieguanyin（TGY）、Huangdan（HD））的研究发现，UGT 基因数量从野生茶树到栽培茶树呈增加趋势，如 DASZ 有 160 个拷贝，YK10 有 191 个拷贝，CSS 品种中基因数量进一步增加（SCZ 为 297 个、LJ43 为 243 个、TGY 为 279 个、HD 为 288 个）（图1 A）。鉴于 SCZ 中 UGT 基因拷贝扩张最显著，后续以其为重点研究对象。
分析 UGT 的共线性和基因复制事件，发现串联重复（TD）事件在茶树 UGT 扩张中起重要作用，且 UGT 基因在 3 个茶树品种中经历了约 2500 万年前（MYA，Ad - β 事件）和约 9000 万年前（Ad - γ 事件）的全基因组复制（WGD）事件（图1 B），表明 WGD 事件对茶树 UGT 基因扩张有重要影响。将 UGTs 分为 18 个系统发育群（A-R）和1个外群（OG）,进一步分析发现，G 组从野生到栽培品种扩张显著（图1 D），在 SCZ 中扩张模式与 YK10 不同（图1 C）；H 组在其他物种中扩张，但在不同茶树品种中仅保留 1 - 2 个拷贝（图1 E），存在谱系特异性收缩。
H 组（UGT76）在拟南芥中是 UGT 基因家族的第二大亚家族，与植物免疫和抗性相关。然而，在茶树（SCZ）中 H 组经历了显著收缩，仅保留一个拷贝（CSS0042294，本研究中称为 UGTH1）
为确定 H 组在茶树中的生物学作用，分析了 UGTH1 在茶树遭受低温、干旱、病原体侵染和茶尺蠖取食等胁迫下的转录水平（图2 A-D）。结果表明，UGTH1 在茶树受病原体侵染后表达上调，说明其可被病害胁迫强烈诱导。通过反义寡核苷酸（AsODN）瞬时抑制 UGTH1 表达，然后用真菌病原体侵染茶树，发现茶树的病斑面积显著增加（图2 E-G），表明 UGTH1 的抑制降低了茶树的抗病性。植物激素在植物抗病中起重要作用，本研究发现抑制 UGTH1 后茶树中水杨酸（SA）相对含量显著降低（图2 H-J），抗病基因 NPR1 和 PR1 的表达水平也降低（图2 K-L），从而降低了茶树的抗病性。但体外实验未发现 UGTH1 可糖基化 N - 羟基哌啶酸（NHP）或 SA 的证据。因此推测 H 组在茶树中可能通过糖基化某些化合物影响 SA 含量，从而参与茶树抗病（图2 M），其生理功能有待进一步研究。3. 自然和人工选择驱动中国种茶树 G 组成员的扩张
G 组（UGT85）成员在茶树中发生了显著扩张，这暗示其与茶树品质或抗性存在潜在联系。分析野生茶树（DASZ）、阿萨姆种（CSA，如 YK10）和中国种（CSS，如 SCZ）茶树中 G 组基因的共线性，发现 YK10 和 SCZ 中的基因与 DASZ 中的 G 组基因具有同源性，但 SCZ 中源自 DASZ 的 GWHTABKB001598 分化为 CSS0047548 和 CSS0011078，与 YK10 中的分化模式不同（图3 A），推测 CSS 中 G 组的扩张可能具有独特特征。
通过在 SCZ 品种 G 组的系统发育树中设置分支节点（a - k），比较各分支的蛋白序列以获取一致序列，计算其 Ks 值来推断最简约的进化历史（图3 B）。结果表明，经过一轮 WGD 和 TD 事件后，SCZ 获得 3 个祖先基因（d、e、c），这些基因在 WGD 和 TD 事件共同作用下持续扩张，表明 WGD 和 TD 共同推动了 SCZ 中 G 组的显著扩张（图3 C）。此外，不同祖先基因形成的 UGT 在系统发育树中形成不同簇，包括 Cluster I、II 和 III，其基因表达模式不同，Cluster I 在所有组织中表达模式一致，Cluster II 和 III 部分基因在所有组织表达，部分仅在根中表达（图3 C）。
对其他物种 UGT 的系统发育分析显示，茶 Cluster II 成员存在分化，基于 Cluster II - 2 和 3 中 UGT 对低温和干旱等非生物胁迫的相反响应，推测其功能发生分化（图3 D-E）。同时，Cluster III 中的 UGT 均响应低温，但仅 Cluster III - 2 响应干旱胁迫，Cluster III - 1 在干旱胁迫下表达无显著变化，推测 Cluster III 中的 UGT 也存在功能分化（图3 E）。对 DASZ、YK10 和 SCZ 中 G 组 UGT 的系统发育分析表明，Cluster III - 1 分支仅存在于 SCZ，通过扫描野生、栽培、地方品种和优良品种的基因组选择性扫描区域，发现 Cluster III - 1 中的 UGT（如 CSS0016082、CSS0042833 和 CSS0030265）核苷酸多样性降低，与野生群体相比 FST 差异显著且 Tajima’s D << 0（图3 F-H），表明这些基因可能受到人工选择。
图3 自然和人工选择驱动中国种茶树 G 组成员的扩张
4. G 组 Cluster II 中 UGT85A53 和 CSS0029711 重复基因对编码酶的底物选择性差异导致其在冷旱响应中的不同作用
为验证 G 组 Cluster II 中 UGT 功能分化的假设，选择 UGT85A53（CSS0018956）和 UGT1（CSS0029711）作为 Cluster II - 2 和 II - 3 的代表，它们对非生物胁迫响应相反。UGT85A53 可糖基化顺 - 3 - 己烯醇和脱落酸（ABA），UGT1 对香叶醇和 β - 香茅醇催化活性最高。酶活性测定结果显示，UGT1 催化香叶醇和 β - 香茅醇产生的游离 UDP 含量分别为 650.2μM 和 584.8μM，催化 UGT85A53 的最佳底物顺 - 3 - 己烯醇和 ABA 时产生的游离 UDP 含量分别为 179.9μM 和 76.19μM，略高于对照（58.0μM）。通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS/MS）测定底物产物量以比较两者底物偏好差异，发现 UGT85A53 和 UGT1 均能糖基化香叶醇、β - 香茅醇和顺 - 3 - 己烯醇产生相应糖苷产物，但 UGT1 不能糖基化 ABA 或其他激素（图4 A），表明 Cluster II 中重复基因对底物选择性不同，对挥发性化合物偏好一致，但对非挥发性化合物（尤其是激素）偏好不同。
为评估底物选择性对功能分化的影响，利用 AsODN 瞬时抑制 UGT85A53 和 UGT1，然后对茶树进行低温和干旱处理。结果显示，在 4°C 下抑制 UGT85A53（AsODN - 1），检测发现茶树损伤增加（图4 C，E-F）；抑制 UGT1（AsODN - 2）则使茶树损伤减少，茶树耐寒性增强（图4 D，G-H）。在干旱处理下，抑制 UGT85A53（AsODN - 3）促进茶树萎蔫，叶片倾角显著增加，耐旱性降低（图4 K，M-O）；抑制 UGT1（AsODN - 4）则使茶树萎蔫减少，叶片倾角显著下降，耐旱性增强（图4 L，P-R）。植物激素在植物应对胁迫中起重要作用，因此把植物激素当作抗逆指标来研究。抑制 UGT85A53 使茶树在低温和干旱胁迫下 ABA 和 ABA - GE 水平降低（图4 I-S），表明 UGT85A53 通过糖基化 ABA 调节茶树的低温和干旱抗性；抑制 UGT1 在低温下使 SA 水平增加，干旱下使 SA 和 JA 含量增加（图4 J-U）。这些结果表明 Cluster II 中的重复基因对可通过不同调控机制在茶树抵御低温和干旱等非生物胁迫中发挥作用，体现了茶树防御机制的适应性。5. G 组 Cluster III 中重复驯化基因 CSS0030265 和 CSS0020241 表现出保守的耐寒性但耐旱性分化
Cluster III 中的重复驯化基因也可能存在功能差异，选择 CSS0030265（UGT3）和 CSS0020241（UGT2）作为 Cluster III - 1 和 III - 2 的代表。对重组蛋白 UGT2 和 UGT3 的酶活性测定表明，UGT2 对 HMF 催化活性最高，且能在体外糖基化紫苏醇和 HMF 产生相应的 O - 葡萄糖苷（图5 A）；UGT3 对植醇催化活性最高，能在体外糖基化植醇产生植醇 - O - 葡萄糖苷（图5 B）。这表明 Cluster III 中受人工选择的重复基因对在底物选择上存在差异，间接影响了茶树香气成分的多样性。
进一步研究 UGT3 和 UGT2 对低温和干旱的响应，同时瞬时抑制 UGT2 和 UGT3。低温处理下，抑制 UGT2 和 UGT3 后茶树损伤程度显著高于对照，茶树耐寒性降低（图5 C-H），同时，对应的 O - 葡萄糖苷相对含量降低（图5 I-K）。表明 UGT2 和 UGT3 分别介导了茶树中 HMF - O - 葡萄糖苷和植醇 - O - 葡萄糖苷的合成。此外，抑制 CsCBF4 会使 UGT2 表达下降，抑制 CsCBF2、CsCBF3 和 CsCBF6 会使 UGT3 表达下降，说明 UGT2 和 UGT3 依赖不同的 CBF 途径增强茶树耐寒性。（注*：CBF 通路是植物响应低温胁迫的关键通路。）干旱条件下，抑制 UGT2 后茶树萎蔫程度、叶片倾角显著增加，相对含水量显著降低（图5 N，P-R），HMF - O - 葡萄糖苷相对含量降低，而紫苏醇 - O - 葡萄糖苷相对含量无显著变化（图5 T），表明 UGT2 抑制降低了茶树耐旱性；抑制 UGT3 后茶树的萎蔫程度、叶片倾角和含水量无显著差异（图5 O，U-W），表明 UGT3 对茶树耐旱性无显著影响。低温下抑制 UGT2 和 UGT3 间接导致茶树中 SA 相对含量显著降低（图5 L-M），降低了茶树耐寒性；干旱下抑制 UGT2 使茶树中 SA 和 ABA 含量显著降低，而抑制 UGT3 对 ABA 相对含量无显著影响（图5 X-Y），这解释了 UGT3 抑制对茶树耐旱性无显著影响的原因。这些结果表明 Cluster III 基因功能分化，其中 Cluster III - 1 基因主要受人工选择影响，对干旱胁迫响应不显著（图5 Z），暗示 CSS 种群驯化过程中可能更注重耐寒性。图5 G组Cluster III中UGT基因的功能验证本研究 Discussion 部分主要讨论了以下内容：
本研究揭示了茶树中 UGT 的显著扩张和谱系特异性收缩，可能与茶树对环境的适应有关。G 组 UGT 在茶树中的扩张和功能分化显著，自然选择影响了茶树的进化轨迹，促进了茶叶品质分化和抗逆性差异，体现了茶树防御策略的多样化。但本研究仅考察了 UGT 的一个代表性亚家族，更多研究有助于揭示 UGT 扩张机制与茶树品质和抗逆性的复杂关系。G 组 Cluster III - 1 在 SCZ 中独特，其基因受人工驯化，对干旱胁迫响应不显著，直接证明了耐寒性是 CSS 种群驯化的主要目标。G 组的扩张和功能分化促进了茶叶风味成分多样化，增强了茶树对非生物胁迫的适应，对提高耐寒性具有重要意义。未来需深入分析 UGT 在 CSA 种群中的功能差异，以更好地理解栽培茶树的进化历史。G 组 Cluster III - 1 在 SCZ 中独特，其基因受人工驯化，对干旱胁迫响应不显著，直接证明了耐寒性是 CSS 种群驯化的主要目标。G 组的扩张和功能分化促进了茶叶风味成分多样化，增强了茶树对非生物胁迫的适应，对提高耐寒性具有重要意义。未来需深入分析 UGT 在 CSA 种群中的功能差异，以更好地理解栽培茶树的进化历史。本研究以探究茶树中尿苷二磷酸依赖型糖基转移酶（UGT）基因家族的进化与功能为核心，旨在揭示其对茶树品质和耐寒性的影响机制。首先，通过对 28 种植物及不同茶树品种的 UGT 基因家族成员进行鉴定、分类和系统发育分析，明确了 UGT 在茶树中的扩张和收缩模式。接着，针对特定的 G 组和 H 组 UGT，深入研究其基因复制事件、表达模式及功能分化。对于 G 组，分析了不同基因簇在茶树生长发育、应对非生物胁迫和香气形成中的作用，以及自然和人工选择对其的影响；对于 H 组，探讨了其在茶树抗病中的潜在机制。最后，综合各项研究结果，阐述了 UGT 基因家族在茶树适应环境变化过程中的重要意义，为茶树的品质改良和抗逆育种提供理论依据。
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通讯作者：
Jingming Wang, Yutong Hu, Danyang Guo, Ting Gao, Tianqi Liu
作者单位：
1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, 130 Changjiang Ave W., Hefei, Anhui 230036, People’s Republic of China.
2. International Joint Laboratory on Tea Chemistry and Health Effects, Anhui Agricultural University, 130 Changjiang Ave W., Hefei, Anhui 230036, People’s Republic of China.
3. Institute of Health Sciences and Technology, Anhui University, 111 Jiulong RD., Hefei, Anhui 230601, People’s Republic of China.
4. Biotechnology of Natural Products, Technische Universität München, Liesel-Beckmann-Str. 1, 85354 Freising, Germany.
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