糖尿病的发展早期以湿热瘀阻为主，火热偏盛，表现为肝热、胃热、肠热、湿热、痰热、毒火等火热内盛之象，治疗以清泄火热为主，属于中医学“消渴病”范畴。中医药治疗“消渴病”具有悠久的历史。《本草纲目》：“治消渴，用酒蒸黄连”，名医别录也记载“黄连止消渴”。《东医宝鉴》记载，黄连为治消渴要药，用时酒浸蒸，晒干为末，蜜丸。黄连首载于《神农本草经》，《中国药典》
2015
年版规定黄连为毛茛科植物黄连
Coptis
chinensis
Franch
、三角叶黄连
Coptis
deltoidea
C. Y. Chenget Hsiao
或云连
Coptis
teeta
Wall.
的干燥根茎，其性味苦、寒，归心、脾、胃、肝、胆、大肠经。
本研究以“证”与“症”是人肠道内微生态变化产生的某些继发反应而导致的表观现象，通过药物调理肠内菌群的平衡，对“证”施以影响起到对症下药达到治疗疾病的目的为切入点，通过
16 S rRNA
基因测序，探究
2
型糖尿病肠道微生物的多样性变化，旨在找出药物治疗疾病时，肠道微生物的变化以及所起的作用，进而影响脑
-
肠
-
菌轴各部分相互作用，调控神经
-
免疫
-
内分泌网络，扶正机体，体现“疗热以寒药”的中医药理论。
1
材料
1.1
仪器
G-421S
血糖试纸、
G-421
血糖仪［爱奥乐医疗器械（深圳）有限公司］；胰岛素检测试剂盒（天津九鼎生物技术有限公司）；
New Classic ML
分析天平（梅特勒
-
托利多公司）；
PHS-3C
雷氏
pH
计（上海精密科学仪器有限公司）。
1.2
药品与试剂
黄连药材（湖北省恩施州利川市佛宝山黄连种植基地），经南京中医药大学药学院陈建伟教授鉴定为黄连
Coptis chinensis
Franch
的干燥根茎；链脲佐菌素（
STZ
，批号
S0130
，
Sigma
公司）；枸橼酸三钠、枸橼酸（广东汕头市西陇化工厂）；羧甲基纤维素钠（
CMC-Na
，上海康朗生物科技有限公司）；氯化钠（南京化学试剂有限公司）；葡萄糖（天津市科密欧化学试剂有限公司）；二甲双胍（批号
02000913
，中美上海施贵宝制药有限公司）；液氮（南京光芒特种气体有限公司）；高脂高糖饲料（北京科澳协力饲料有限公司）。
1.3
动物
健康雄性
SD
大鼠，体质量
200
～
220 g
，
SPF
级，购买于南京市江宁区青龙山动物繁殖场，许可证号
SCXK
（浙）
2014-0001
，饲养于南京中医药大学实验动物中心屏障动物饲养室，按屏障环境内动物实验观察与操作规范进行实验。
2
方法
2.1
黄连提取物的制备
取黄连药材
2 kg
，加
5
倍量水，加热回流
2
次，每次
2 h
，真空干燥成粉状（
HPLC
测得其中含盐酸小檗碱
7.5%
、巴马汀
1.68%
、黄连碱
2.7%
，表小檗碱
2.2%
），置于干燥器中待用。
2.2
糖尿病大鼠模型制备
SD
大鼠以特殊膳食与
STZ
联合诱导造模，即以高脂高糖饲料（
20%
蔗糖、
15%
猪油、
5%
蛋黄粉、
60%
基础饲料）喂养大鼠
1
个月，禁食不禁水
12 h
，一次性
ip
给予
5 mg/kg STZ
（采用
pH 4.2
～
4.5
的
0.1 mol/L
枸橼酸三钠
-
枸橼酸缓冲液配制），
3 d
后测定血糖，
2
周后血糖依旧稳定，且空腹血糖≥
11.1 mmol/L
者纳入
2
型糖尿病模型。
2.3
分组与给药
未造模前按体质量随机选取
10
只大鼠为对照组，将造模成功的
30
只大鼠，以血糖值随机分为
3
组，分别为模型组、阳性对照二甲双胍组、黄连提取物组，每组
10
只；二甲双胍组
ig
给予一定剂量（
0.097 g/kg
）二甲双胍，黄连提取物组
ig
给予黄连提取物
4.36 g/kg
（根据人临床剂量每天
45 g
折算），对照组与模型组
ig
等体积
0.5% CMC-Na
，每天给药
1
次，连续给药
30 d
。
2.4
口服糖耐量的测定
给药
4
周后，空腹
12 h
，每组以
2 g/kg
剂量
ig
葡萄糖，分别测定给予葡萄糖后
0
、
15
、
30
、
60
、
120 min
的血糖值。
2.5
空腹血糖和胰岛素水平的测定
末次给药后，各组大鼠禁食不禁水
12 h
，眼眶取血，用血糖仪测定空腹血糖值，按试剂盒方法测定胰岛素水平，计算其胰岛素抵抗指数（
HOMA-IR
）。
HOMA-IR
＝空腹胰岛素值×空腹血糖值
/
22.5
2.6
体质量
和
尿量的检测
给药期间，每周检测
1
次体质量。末次给药后，称各组大鼠体质量，将各组大鼠置于代谢笼中，收集每只大鼠
24 h
尿液，测定尿量。
2.7
粪便取样与检测
给药
4
周后无菌采集对照组、模型组、黄连提取物组大鼠的直肠段内容物于冻存管中，立即存放至液氮中，
2 h
后取出干冰运送至上海美吉生物医药科技有限公司，进行
16 S rRNA
基因测序检测。
2.8
数据处理
采用
SPSS 13.0
软件进行统计分析，数据用
表示，采用单因素方差分析进行统计，组间比较采用
LSD
多重比较。检测显著丰度差异特征、筛选与丰度有显著性差异的类群以及每个组分（物种）丰度对差异效果影响的大小使用
non-parametric factorial Kruskal-Wallis (KW) sum-ranktest
（非参数因子克鲁斯卡尔
-
沃利斯秩和验检）以及线性判别分析（
LDA
）软件
LEfSe
（
http://huttenhower.Sph. harvard.edu/galaxy/root?tool_id
＝
lefse_upload
）。数据去杂和参数的设置使用软件
FLASH
、
Trimmomatic
；使用软件平台：
Usearch
（
vsesion 7.0 http://drive5.com/uparse/
）；分类学分析采用
RDP classifier
贝叶斯算法对
97%
相似水平的
OTU
代表序列进行分类学分析，参考
16 S
细菌和古菌核糖体数据库
Silva
（
Release128 http://www.arb-silva.de
）。
3
结果
3.1
口服糖耐量测定结果
由图
1-A
可以看出，黄连提取物组与模型组相比，血糖上升的幅度以及血糖的最大值都明显降低，说明黄连能够有效地改善
2
型糖尿病大鼠的糖耐量。
3.2
各组大鼠尿量与体质量比较
黄连提取物组与模型组相比大鼠体质量显著提高（
P
＜
0.05
），大鼠尿量明显降低（
P
＜
0.05
），说明黄连提取物能够改善
2
型糖尿病大鼠体质量减轻与尿量增多的症状，各组大鼠体质量和尿量测定结果见图
1
。
3.3
各组大鼠空腹血糖、胰岛素水平和
HOMA-IR
比较
与对照组比较，模型组大鼠空腹血糖和
HOMA-IR
显著升高（
P
＜
0.001
），与模型组比较，黄连提取物组大鼠空腹血糖和
HOMA-IR
均显著降低（
P
＜
0.01
），结果见表
1
。
3.4
肠道微生物测序结果
根据
16 S rRNA
的测序结果，采用
RDP classifier
贝叶斯算法对
97%
相似水平的
OTU
代表序列进行分类学分析，参考
16 S
细菌和古菌核糖体数据库
Silva
（
Release128 http://www.arb-silva.de
），得到了
951
个
OTU
，
15
个门、
25
个纲、
43
个目、
69
个科、
182
个属、
357
个种。图
2
的数据结果得到
P
＝
0.001
，说明组间具有统计学意义。图
3
的聚类结果表明各组间微生物群落物种有明显差异。由图
4
可知对照组、模型组与黄连提取物组中拟杆菌
门（
Bacteroides
）、厚壁菌门（
Firmicutes
）的丰度都较高，为优势菌群；在对照组中拟杆菌门（
Bacteroides
）的丰度高达
53.07%
，厚壁菌门在模型组中的丰度高达
43.23%
，且在黄连提取物组中梭杆菌门（
Fusobacteria
）的丰度显著高于对照组与模型组（
P
＜
0.01
），而在模型组中放线菌门
（
Actinobacteria
）的丰度明显高于对照组与黄连提取物组（
P
＜
0.05
）；脱铁杆菌门（
Deferribacteres
）只在模型组中含有，在对照组与黄连提取物组中，
均
未检测到，说明在经膳食联合
STZ
诱导的
2
型糖尿病模型中放线菌门与脱铁杆菌门可能是潜在的标志菌。螺旋体门（
Spirochaetae
）、柔膜菌门（
Tenericutes
）、脱铁杆菌门、黏胶球形菌（
Lentisphaerae
）在黄连提取物组中均未检测到，说明黄连提取物对其可能有一定的抑制作用；厚壁菌门、螺旋体门、柔膜菌门、迷踪菌门（
Elusimicrobia
）在模型组中丰度高于对照组，而黄连提取物组中的丰度有所降低；在黄连提取物组中变性菌门（
Proteobacteria
）、梭杆菌门、疣微菌门（
Verrucomicrobia
）的丰度略高于对照组与模型组，提示黄连提取物可能可以改善模型大鼠肠道菌群的紊乱。由图
5-A HeatMap
中颜色变化与相似程度可以更直接地比较对照组、模型组与黄连提取物组在门水平上群落组成的相似性与差异性，图
5-B
中，分析了
15
个门与口服糖耐量曲线下面积（
AUC
）与
HOMA-IR
的相关性，由图可知梭杆菌门的相关性较低，而放线菌门与脱铁杆菌门相关性较高。由图
6
可知不同门之间的进化远近关系，值得注意的是，拟杆菌门进化距离最大，说明其与厚壁菌门等菌种的进化关系较远。
4
讨论
运用黄连治疗消渴症具有一定的依据，有关研究报道黄连的主要成分是异喹啉类生物碱，主要包括小檗碱、巴马汀、黄连甲基碱等，其中小檗碱是其主要成分。小檗碱可以通过调节
P
细胞功能抑制
糖原异生或者促进糖酵解产生起到降血糖的作用
[1]
，
改善胰岛素抵抗，且小檗碱还具有降低血清胆固醇（
TC
）、三酰甘油（
TG
）、低密度脂蛋白胆固醇（
LDL-C
）等作用，其作用机制可能是通过调节细胞外信号调节激酶（
ERK
）的活性，转录后提高低密度脂蛋白受体（
