科研 | 南大&南中医：葛根素通过调节肠道菌群和代谢且直接抑制巨噬细胞M1极化从而缓解结肠炎（国人佳作）

原名： Puerarin ameliorates colitis by direct suppression of macrophage M1 polarization in DSS mice

译名： 葛根素通过直接抑制DSS小鼠巨噬细胞M1极化改善结肠炎

期刊： Phytomedicine

IF： 6.7

发表时间： 2024.09

通讯作者： 王雷&高千

通讯作者单位： 南京中医药大学&南京大学

我们最初进行了一项实验，以评估葛根素（化学式如图1A所示）在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中的治疗效果（图1B）。DSS组的小鼠体重明显减轻（图1C）。此外，这些小鼠出现了严重的结肠炎，疾病活动指数（DAI）评分升高（图1D）、结肠长度缩短（图1E）和实质性组织病理学病变（图1G）证明了这一点。qPCR检测到结肠组织中IL-6和IL-1β的炎性细胞因子水平升高（图1F），表明了局部炎症。这得到了蛋白质印迹分析的支持，该分析显示iNOS、IL-1β、TLR2和磷酸化NF-κB p-p65的水平升高（补充图1A&B）。此外，DSS导致脾脏明显增大（图1H），ELISA分析确定循环中IL-6和IL-1β水平升高（图1I），表明全身免疫改变。与NC小鼠和阿司咪唑（200mg/kg）处理的小鼠相比，葛根素处理，特别是160mg/kg的剂量，显著改善了DSS组中所有病理表型（图1C-H）。因此，160 mg/kg剂量的葛根素在改善DSS结肠炎方面是安全有效的。RT-PCR引物如表1所示。

图1 葛根素改善了DSS小鼠的全身和局部表型。 （A）葛根素的化学结构。（B）实验的示意图。（C&D）体重和疾病活动指数（DAI）曲线。（E）结肠的代表性形象。（F）qPCR检测IL-6和IL-1β的mRNA水平。（G）结肠的H&E染色。比例尺=200µm。箭头指向肠道炎症损伤的部位。（H）脾脏的代表性图像。（I）ELISA法测定小鼠眼血清中IL-6和IL-1β的水平。数据以平均值±标准差表示，n=6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

表1 用于qRT-PCR的引物列表

为了评估肠道屏障功能，我们进行了FITC-D渗漏研究。与NC组相比，DSS处理的小鼠中检测到FITC-D泄漏显著增加，这是在施用荧光染料四小时后通过体内成像确定的。葛根素（160 mg/kg）显著降低了体内图像中泄漏荧光的强度和面积（补充图1C-D）。相应地，qPCR证实了渗透性相关基因Occludin和ZO-1表达的减少（补充图1E）。为了阐明DSS结肠炎中肠漏与上皮完整性之间的联系，我们在相同的实验背景下观察了Occludin。DSS严重破坏了正常的上皮形态，显著降低了Occludin的表达，并破坏了其膜结合，如免疫荧光所示（补充图1F）。葛根素可显著逆转这些作用。

此外，如免疫印迹分析所示，DSS小鼠的结肠中IL-17受体衔接蛋白Act-1和IL-17RC的蛋白质水平显著降低（补充图1G），这两种蛋白是上皮细胞内IL-17/Act-1信号传导的关键参与者，对维持屏障功能和调节Occludin的表达和定位至关重要。葛根素有效地逆转了这些减少。最后，PAS染色，也称为杯状细胞染色，显示了上皮结构的显著丧失，表现为DSS小鼠结肠病变中杯状细胞的丧失（补充图1H&I）。葛根素恢复了上皮结构，包括杯状细胞的存在，这与Klf4和Muc2的表达一致（补充图1J）。

我们旨在鉴定参与DSS诱导的结肠炎的关键免疫细胞。流式细胞术分析显示，与NC小鼠相比，DSS小鼠的MLN中CD4 ⁺ T细胞、γδT细胞和巨噬细胞显著增加。葛根素显著减少了巨噬细胞数量，而CD4 ⁺ T细胞保持不变，γδT细胞显著增加（图2A）。此外，巨噬细胞在结肠炎患者和DSS小鼠的结肠组织中显著富集（图2B）。葛根素显著降低了DSS小鼠结肠中巨噬细胞的存在。

图2 葛根素的治疗作用需要巨噬细胞 。 （A）通过流式细胞术分析NC、DSS和DP组MLN中Th17细胞、γδT细胞和巨噬细胞的比例。（B）人和小鼠结肠组织中F4/80的免疫荧光染色。比例尺=50μm。箭头指向肠道中巨噬细胞富集的区域。（C-D）试验小鼠的体重和疾病活动指数。（E-F）结肠长度和脾脏外观的代表性图像。（G）巨噬细胞清除小鼠结肠的F4/80免疫组织化学染色。比例尺=100µm箭头指向肠道中巨噬细胞富集的区域。（H）巨噬细胞清除小鼠结肠组织的H&E染色，比例尺=200µm。箭头指向肠道炎症损伤区域。（I）通过ELIS A测定小鼠眼血清中IL-6、IL-1β、IL-10和TNF-α的水平。数据表示为平均值±标准差，n=6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

由于CD4 ⁺ T细胞（Th1和Th17细胞）是促炎细胞，参与促进结肠炎病变，并且在目前的研究中没有被葛根素减少，这表明葛根素通过直接调节T辅助细胞来改善DSS结肠炎的效果不太可能。相反，它可能通过促进在结肠炎中具有保护作用的γδT细胞，或通过下调巨噬细胞，或两者兼而有之来发挥作用。为了区分这两者，我们通过敲除γδT细胞（TCRδ ^-/- ）消除了结肠炎背景下的γδT淋巴细胞。如TCRδ ^-/- 所示，DSS诱导了更严重的结肠炎，结肠长度进一步缩短和更严重的组织病理学病变证明了这一点（补充图2A&B）。DSS在结肠病变中引发了巨噬细胞和中性粒细胞更集中的侵袭（补充图2C&D），而葛根素大大减少了具有TCRδ ^-/- 的DSS小鼠的结肠炎病理和炎性细胞侵袭，表明γδT细胞以外的细胞也参与其中。

为了测试巨噬细胞在介导葛根素改善结肠炎中是否更为重要，我们建立了一个巨噬细胞耗竭模型。结果显示，与DSS小鼠相比，DSS+Mø ^-/- 小鼠的结果有所改善，包括体重增加、DAI指数降低、结肠组织中F4/80表达减少、结肠长度增加和脾脏体积减少。巨噬细胞清除后给予葛根素并没有进一步改变疾病表型（图2C-G），表明葛根素的益处主要通过巨噬细胞介导。组织切片显示，与DSS组相比，DSS+Mø ^-/- 和DSS+M ^-/- +PUE组的结肠病变也有类似的减少（图2H）。血清炎症因子反映了这些病理结果，在DSS小鼠中显示出M1样细胞因子模式，这可以通过使用或不使用葛根素的巨噬细胞耗竭来逆转（图2I）。这些结果表明，巨噬细胞是DSS结肠炎中介导葛根素治疗作用的关键致病成分。

为了研究葛根素是否直接作用于巨噬细胞，我们进行了一项体外研究。CCK8检测表明，葛根素浓度为20µM或更低时，对细胞存活率没有影响（图3A）。然后，我们使用LPS在Raw264.7细胞中建立了M1样炎症模型，以模拟体内DSS小鼠模型。流式细胞术分析显示，LPS处理的Raw264.7细胞中CD80显著上调，对CD206的影响很小。葛根素通过以浓度依赖的方式显著下调CD80来减轻LPS诱导的细胞炎症，对CD206没有明显影响（图3B）。LPS处理显著增加了促炎基因iNOS和IL-6的表达，同时降低了抗炎基因Arg1的表达。葛根素显著逆转了这些基因表达的变化（图3C）。

图3 葛根素直接作用于巨噬细胞 。 （A）通过CCK8测定法测定细胞存活率（n=5）。（B）使用CD80和CD206通过流式细胞术评估细胞极化。（C）Raw264.7细胞iNOS、IL-6和Arg1的qPCR。mTORC1通路基因和UPR基因的（D-E）qPCR。通过qPCR检测（F-G）MHCII基因和MHCI基因。数据表示为平均值±标准差，n=3，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

葛根素显著刺激了mTORC1信号基因mTOR、Chac1和未折叠蛋白反应（UPR）基因PERK、Sqstm1、Trib3和ATF6，而与LPS的存在无关（图3D-E）。因此，葛根素不仅可以对抗LPS诱导的巨噬细胞炎症基因表达，还可以通过促进mTORC1信号传导和UPR基因表达来预处理细胞的应激反应。此外，葛根素显著增加了MHCII基因H2Aa、H2-Ab1、H2-Eb1和H2-B1以及MHCI基因H2-D1和H2-K1的表达，与LPS处理无关（图3F-G）。这表明葛根素增强了与炎症调节和免疫平衡相关的巨噬细胞功能。

我们使用体外葛根素处理或未处理的Raw264.7细胞评估了葛根素预处理巨噬细胞在结肠炎中的作用。在DSS结肠炎中，与DSS组相比，输注Raw264.7细胞的小鼠（DR小鼠）表现出进一步的体重减轻、DAI评分增加和结肠长度缩短。相反，输注葛根素处理的Raw264.7细胞的小鼠（DRP小鼠）在体重、DAI指数和结肠长度方面显示出显著改善（图4A&B，图D）。病理分析显示，与DSS组相比，DR组的炎性细胞浸润和组织损伤更为严重，而DRP组在各种表型上都有显著改善（图4C）。ELISA证实DRP小鼠循环中IL-1β、TNF-α和IL-6减少，IL-10增加（图4E）。我们使用骨髓源性巨噬细胞（BMDM）的实验在各个水平上证实了这些发现（图4F-I）。

图4 葛根素预处理的巨噬细胞具有抗结肠炎作用 。 （A-C）输注有/没有葛根素处理的Raw264.7细胞。展示了受试小鼠的体重和DAI曲线，以及结肠H&E染色的代表性图像。比例尺=200µm。箭头指向肠道炎症损伤区域。（D）展示了受试小鼠结肠长度的代表性图像。（E）通过ELISA法测定小鼠眼血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和IL-10的水平。（F-H）BMDM细胞输注研究。结肠、脾脏和结肠组织H&E染色的代表性图像，比例尺=100µm。箭头指向肠道炎症损伤区域。（I）qPCR检测BMDM输注后结肠组织中iNOS和TNF-α的含量。数据表示为平均值±标准差，n=6，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001。

由于DSS在巨噬细胞M1激活中的作用无法在体外确定，我们假设DSS可能通过体内成分（如肠道微生物群）影响巨噬细胞的极性。在DSS组中，α多样性和NMDS降维分析均显示肠道微生物群特征发生了显著变化，表明整体生态失调（图5A-B）。在门水平上，NC小鼠表现出较低的Campylobacterota和疣微菌门丰度，在DSS小鼠中增加，葛根素处理后逆转，而拟杆菌在各组中表现出相反的模式（图5C）。在这两种物种之间，嗜黏蛋白阿克曼菌在 p_Verrucomicrobiota 中占主导地位，因为它们在DSS小鼠中增加和在DP小鼠中减少相似，而 f_Lachnospiraceae 中 Lachnospiraceae NK4A136 group 的丰度遵循这种模式，但该科中的其他物种则没有（图5D&E）。LEfSe分析表明，DSS组富含p_Campylobacterota、p_Cyanobacteria、和p_Verrucomicrobiota，对厚壁菌门中的o_Scilliospirales、o_Peptococcales和o_Clostrida vadinBB60 group有广泛影响。相比之下，NC组和DP组主要富含p_Deferribactera、p_Desulfobacterota、p_Firmicutes的o_Lachnospirales、p_Firmicutes中的o_Lactobacillales和p_Proteobacteria中的o_Enterobacterales（图5F）。差异OTU丰度分析确定了67个DSS富集的OTU被葛根素逆转（被认为是有害菌），18个OTU具有相反的模式（图5G）。我们在前5个有害菌中，对OTU10（ Lachnospiraceae NK4A136 group ）和OTU52（阿克曼菌）在物种水平上进行了注释。嗜黏蛋白阿克曼菌在 p_Verrucomicrobiota 和 Lachnospiraceae NK4A136 group 中占主导地位，在DSS小鼠中显示出相似的增加模式，而葛根素则显示出类似的减少模式（图5G）。OTU52与代谢产物或细菌的关系如表2所示。