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Nature | 量化人类线粒体基因组的约束

BioArt · 公众号 · 生物 · 2024-11-01 08:58

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撰文 | 马艾乐

线粒体DNA （mtDNA）在人体健康和疾病中扮演重要角色。研究显示，mtDNA变异与多种疾病有关，例如自闭症、癌症、神经退行性疾病（如阿尔茨海默症和帕金森症）等。然而，由于mtDNA结构紧凑、突变率高，且缺乏核DNA的保护机制，科学分析和识别mtDNA中的关键变异位点成为一大挑战。

近日，美国耶鲁大学医学院 Nicole J.Lake 与 Monkol Lek 团队在 Nature 发表了题为 Quantifying constraint in the human mitochondrial genome 的研究， 首次通过量化mtDNA的变异约束性，建立了帮助识别致病突变的新工具，为线粒体DNA在健康和疾病研究中提供了突破口。

线粒体负责产生人体绝大部分的能量，它所携带的线粒体DNA （mtDNA）具有许多独特特征。mtDNA是小型环状DNA，仅包含约16.5千碱基对，主要编码13个蛋白质基因、22个tRNA基因和2个rRNA基因，均无内含子，且只通过母系遗传。与核DNA不同，mtDNA没有保护性修复机制，因此突变率较高。这些特性使得mtDNA极易发生突变，并增加了其致病变异的风险。然而，由于mtDNA变异的复杂性，传统分析方法难以有效识别致病性突变。

为此，研究团队开发了“ 线粒体复合似然模型 ” （Mitochondrial Composite Likelihood Model），能够以更高的精确度识别出mtDNA中的关键变异位点。该模型结合了大规模人群数据，对mtDNA中不同位置的突变进行了量化分析，为理解mtDNA变异的生物学意义提供了新的工具。

线粒体复合似然模型：

这项研究中，研究人员以“线粒体复合似然模型（Mitochondrial Composite Likelihood Model） ”的方法，来量化mtDNA变异的敏感性。这个模型的核心是通过计算每个位点的突变概率，来估算mtDNA的“中性突变水平”，从而帮助科学家评估每个位置的变异约束性（即对变异的敏感度）。线粒体DNA与核DNA的突变特性不同，因此无法直接套用传统的核基因组突变模型。例如，mtDNA更容易发生碱基转换（如C>T或A>G），而非碱基颠换（如C>G）。此外，mtDNA的某些区域（如复制起始点）突变率较高，因此需要一个适配于mtDNA特性的专属模型。

复合似然模型的运作：

复合似然模型的核心在于，它不仅仅考虑突变位置的碱基，还融入了三核苷酸上下文（即突变位点及其相邻的两个碱基）对突变的影响。具体来说，模型基于突变数据集（来自文献数据和母子配对数据），统计每种三核苷酸组合的突变概率，从而计算出每个位点在不同突变类型下的变异概率。这种模型不仅适应了小基因组的特性，还充分考虑了上下文的影响，提高了突变预测的精确性。

模型完成后，研究者们将其应用于全球最大的人群线粒体变异数据库——gnomAD。这一数据库记录了56,434名参与者的mtDNA数据。通过比对模型预测的中性突变率（即“预期突变率”）和gnomAD中实际观察到的变异，研究团队得出了观察与预期的比值（O/E比值），这是衡量mtDNA不同位点对变异的敏感度的重要指标。低O/E比值意味着该位置对突变的容忍度较低，即有较高的选择性压力。这种分析方式帮助研究者识别出mtDNA中那些功能上极为重要的区域，例如复合体I亚基基因的终止突变区域，若这些区域发生突变则会严重影响细胞的存活。

高约束性位点：

通过复合似然模型计算出的数据，研究者识别出了一些对变异高度敏感的位点，这些位点往往集中在对细胞功能至关重要的区域。这些高约束性位点包括：

1. 蛋白质基因的关键区域： 例如复合体I亚基（MT-ND1、MT-ND2、MT-ND4等）和复合体IV基因中的铜离子结合位点，这些区域在细胞的氧化磷酸化中至关重要。复合体I和IV的非同义突变O/E比值较低，表明这些区域对突变高度敏感，这些缺陷通常是儿童线粒体疾病的主要原因。

2. tRNA和rRNA的结构域： 在tRNA和rRNA中，破坏双链Watson-Crick碱基对的变异具有较高的选择性压力（低O/E比值）。例如，tRNA的D茎结构表现出最强的约束性（O/E比值为0.15），而T环的约束性较弱（O/E比值为0.72）。

3. 非编码区的调控区域： 尽管不编码蛋白质，非编码区的一些关键区域（如复制和转录起始点）对变异显示出显著约束性，这些区域在mtDNA的复制和表达中有重要作用。

MLC score：

为了更直观地识别出这些对变异敏感的关键位点，研究团队开发了局部约束评分（MLC score）。研究者使用 滑动窗口方法 计算MLC评分，即对基因组的每个位点及其周边的碱基进行局部变异耐受性分析，从而得到每个位点的变异约束评分（MLC评分），得分范围为0到1。 高MLC评分 （接近1）表示该位置对变异高度敏感，低MLC评分则意味着该位置对变异更具耐受性。

1. 高MLC评分的关键位置： 研究团队发现了一些具有非常高MLC评分的位点（评分>0.99），这些位点集中在对细胞功能至关重要的区域。例如，MT-CO1和MT-CO2这两个复合体IV基因中的铜离子结合位点具有极高的约束性，铜是复合体IV中一种必需的金属，参与细胞的氧化磷酸化功能。此外，复合体I抑制剂罗通酮（rotenone）的结合位点也表现出高度约束性，这一位置对于复合体I的功能至关重要。

2. RNA中的高MLC评分位点： 在rRNA的高MLC评分位点中，研究发现了与tRNA和mRNA结合的关键碱基，表明这些位点在线粒体翻译过程中扮演重要角色。

3. 非编码区的约束分布： 非编码区域的MLC评分较低，表明这些区域更能容忍变异，但在轻链复制起始点（OriL）或控制区的一些位置也存在一定的约束性，这些区域通常与mtDNA的复制和转录调控有关。

体外评估高约束性位点 ：

为验证MLC评分的预测准确性，研究团队使用线粒体碱基编辑工具DdCBE在体外细胞中制造特定位点的突变，并观察其对细胞的实际影响。研究选择了几个高MLC评分位点（如MT-RNR2基因中的m.3047G>A和m.3075G>A）和一个对照位点（无约束性同义突变MT-ND2 m.5147G>A）。

实验中，突变细胞被培养在含葡萄糖和半乳糖的培养基中。半乳糖条件下，细胞必须依赖线粒体氧化磷酸化提供能量，若线粒体功能受损，细胞生长将受到抑制。实验结果显示，高MLC评分位点突变的细胞在半乳糖培养基中生长受阻，且氧气消耗率（OCR）显著下降，表明突变严重影响了线粒体的正常功能。而无约束对照突变位点的细胞未表现出显著生长缺陷，验证了MLC评分的准确性。

本研究为识别mtDNA中潜在的致病性突变提供了新的工具。 MLC评分系统不仅可以识别高风险的致病变异，还可以帮助临床研究者进行疾病筛查，辅助诊断线粒体相关疾病，或用于个性化治疗中的基因检测。未来，MLC评分有望应用于更大规模的人群研究中，帮助识别不同人群中的特定mtDNA变异风险，推动mtDNA在遗传病中的研究和应用。通过这些工具， 研究人员可以主动预测和评估mtDNA突变的潜在风险，为疾病早期筛查和基因疗法提供重要支持。

本文由美国耶鲁大学医学院Nicole J.Lake作为第一作者，Nicole J.Lake与Monkol Lek作为共同通讯作者。Lek实验室专注于罕见遗传病的诊疗技术的开发，现招聘博士后研究人员及学士后研究助理。欢迎有志于深入探索相关领域的同行联系。本推送由耶鲁大学生物统计专业硕士生马艾乐撰稿，马艾乐目前在寻找与生物统计相关的职业机会。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41586-024-08048-x

制版人：十一

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