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基于“成分-靶点-通路”的枸杞子调控年龄相关性黄斑变性作用机制研究

中草药杂志社 · 公众号 · 药品 · 2021-02-26 07:41

正文

摘要：目的采用网络药理学方法探讨枸杞子改善年龄相关性黄斑变性（ age-relatedmacular degeneration ， AMD ）的活性成分及作用机制。方法以检索 TCMSP 数据库和查阅文献获得的枸杞子潜在活性成分为研究对象，通过 SwissTarget Prediction 平台、 GeneCards 数据库、 OMIM 数据库、 DDT 数据库和 Drugbank 数据库预测活性成分的潜在靶点；应用 Metascape 平台对潜在靶点进行基因本体（ gene ontology ， GO ）功能富集分析和京都基因与基因组百科全书（ Kyoto encyclopedia of genes and genomes ， KEGG ）富集分析；运用 String 数据库和 Cytoscape 软件构建蛋白相互作用（ protein-protein interaction ， PPI ）网络和 “ 药物 - 成分 - 靶点 - 通路 - 疾病 ” 网络；考察枸杞子不同提取部位对碘酸钠诱导的人视网膜色素上皮细胞 ARPE-19 活力的影响，以及对脂多糖诱导的小鼠小胶质细胞系 BV2 中炎症因子表达的影响。结果枸杞子中的 88 个活性成分通过调控血管内皮生长因子 A （ vascularendothelial growth factor A ， VEGFA ）、白细胞介素 -8 （ interleukin-8 ， IL-8 ）、白细胞介素 -6 （ interleukin-6 ， IL-6 ）、肿瘤坏死因子（ tumor necrosis factor ， TNF ）、基质金属蛋白酶 -9 （ matrix metalloproteinase-9 ， MMP-9 ）等靶点，参与氧化应激、炎症反应等生物学过程，影响晚期糖基化终末产物（ advanced glycation end products ， AGE ） - 晚期糖基化终末产物受体（ receptorfor advanced glycation end products ， RAGE ）、 IL-17 、 TNF 等信号通路发挥改善 AMD 的作用。枸杞子 95% 乙醇提取部位能够显著提高碘酸钠诱导的 ARPE-19 细胞活力（ P ＜ 0.001 ），并显著降低脂多糖诱导的 BV2 细胞中 IL-6 、 IL-1β 、 TNF-αmRNA 表达水平（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ）。结论枸杞子中多种成分具有影响 AMD 相关靶点的潜在作用，枸杞子能够通过改善氧化损伤、抑制炎症反应治疗 AMD ，为后续深入研究枸杞子中不同活性成分调节 AMD 的作用机制提供依据。

年龄相关性黄斑变性（ age-relatedmacular degeneration ， AMD ）多发于 60 岁以上的老人，主要影响视网膜中央凹黄斑区域，可导致永久性视力障碍或失明，严重影响患者的生活质量。对 AMD 患病率的最新荟萃分析显示 ^[1] ， 45 ～ 85 岁人群 AMD 的患病率约为 8.7% ，其中早期患病率约为 8% ，晚期患病率约为 0.4% 。随着人口老龄化加剧，预计 2040 年全球受 AMD 影响的人数将增加至 2.88 亿 ^[2-3] 。作用于血管内皮生长因子（ vascular endothelialgrowth factor ， VEGF ）的药物可降低失明和严重视力损害 ^[4-5] ，但国际上尚无治疗干性 AMD 的药物。

中医学认为， AMD 属于“视直为曲”“视瞻昏渺”“暴盲”的范畴。《灵枢 · 大惑论》中“五脏六腑之精气皆上注于目而为之精”，明确了眼睛与脏腑之间的关系。中医学认为肝肾亏虚、脾气虚弱是 AMD 的基本病机，滋补肝肾、活血化瘀、益精明目 AMD 的基本治法 ^[6-7] 。枸杞子为茄科植物 宁夏枸杞 Lycium barbarum L. 的干燥成熟果实，《本草纲目》中记载“枸杞子除邪热、明目轻身，可用于虚劳亏损、眩晕耳鸣、内热消渴、目眩不明等病症”。枸杞子中化学成分较为丰富，主要包括多糖、糖脂、甾醇及固醇类、黄酮类、类胡萝卜素、酰胺类、生物碱、氨基酸、脂肪酸、萜类等成分。研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗炎、免疫调节、神经保护等作用 ^[8-9] ，为治疗 AMD 的常用代表中药 ^[10] 。

网络药理学融合了系统生物学、多向药理学和计算机分析技术，通过多层次阐明药物的作用机制，具有整体性、系统性的特点，与中医药治疗的整体性和协同性相契合 ^[11-12] 。本研究采用网络药理学构建“药物 - 成分 - 靶点 - 通路 - 疾病”网络，从整体揭示枸杞子对 AMD 的干预作用及其机制，为后续深入研究枸杞子中不同活性成分调节 AMD 的作用机制以及抗 AMD 药物的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 活性成分的收集

通过中药系统药理学数据库与分析平台（ TCMSP ， http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php ） ^[13] 以口服生物利用度≥ 30% 、类药性≥ 0.18 为筛选条件，结合国内外文献调研获取枸杞子活性成分信息，通过 PubChem 数据库和 ChemDraw 18.0 软件获得活性成分的分子结构。

1.2 靶点的预测与筛选

以筛选所得的活性成分为研究对象，通过 TCMSP 、 Swiss TargetPrediction 平台（ http://www.swisstargetprediction.ch/ ） ^[14] 预测靶点。以“ AMD ”“湿性 AMD ”“新生血管性 AMD ”“湿性 AMD ”“地图样萎缩”为疾病关键词，通过 OMIM （ https://omim.org/ ）、 GeneCards （ https://www. genecards.org/ ）、 TTD （ http://db.idrblab.net/ttd/ ）和 DurgBank （ https://www.drugbank.ca/ ）数据库进行检索，并与枸杞子靶点取交集，获得枸杞子改善 AMD 的潜在靶点。

1.3 蛋白相互作用 （ protein-protein interaction ， PPI ）网络构建

为了明确枸杞子活性成分与 AMD 靶点之间的对应关系，取二者靶点的交集，通过 STRING （ https://string-db.org ）数据库构建交集靶点 PPI 网络，将生物种类设定为人类，最小相互作用阈值设定为 0.4 。通过 Cytoscape 3.7.2 软件中 MCODE 和 Network Analyzer 功能对 PPI 网络进行聚类分析和拓扑分析，获得枸杞子调控 AMD 的核心靶点。

1.4 基因本体 （ geneontology ， GO ）富集分析与京都基因与基因组百科全书 （ Kyoto encyclopediaof genes and genomes ， KEGG ）通路分析

将枸杞子改善 AMD 的靶点输入 Metascape 平台（ https//www.metascape.org ），将生物种类设定为人类，设置 P ＜ 0.001 ，进行 GO 富集分析和 KEGG 通路分析，保存数据并进行可视化处理。

1.5 “ 药物 - 成分 - 靶点 - 通路 - 疾病 ” 网络的构建

将枸杞子活性成分、潜在靶点与疾病通路富集分析结果进行映射，导入 Cytoscape 软件，构建“药物 - 成分 - 靶点 - 通路 - 疾病”网络图。

1.6 实验验证

1.6.1 细胞株人视网膜色素上皮细胞 ARPE-19 和小鼠小胶质细胞系 BV2 均购自上海赛百慷公司。

1.6.2 药物及提取物制备枸杞子（批号 1612102 ）购自宁夏明德中药饮片有限公司，经南京中医药大学中药资源产业化过程协同创新中心段金廒教授鉴定为茄科植物宁夏枸杞 L. barbarum L. 的干燥成熟果实。按图 1 提取流程制备得到枸杞子水提取液（ ST ）、多糖部位（ DT ）、水部位（ SBW ）、 30% 乙醇部位、 70% 乙醇部位、 95% 乙醇部位、水提后醇提取液（ SC ）和色素部位（ SS ）。各样品经离心浓缩或冻干后，称取 10 mg 溶于 DMSO 配制成质量浓度为 10 mg/mL 的母液，经 0.22 μm 滤膜滤过，于 − 20 ℃保存备用。

1.6.3 试剂 DMEM/F-12 培养基（批号 10092011 ）、 MEM-Eagle 培养基（批号 12120005 ）购自 Corning 公司； 0.25% 胰蛋白酶（批号 2038152 ）、胎牛血清（批号 2177370 ）、青霉素 - 链霉素 - 制霉素溶液（批号 2012208 ）购自 Gibco 公司；噻唑蓝溴化四唑（批号 I1810035 ）、碘酸钠（批号 E1802068 ）购自 Aladdin 公司；脂多糖（批号 12180309 ）购自 Sigma 公司； Trizol （批号 176908 ）购自 Life Technology 公司； FastKing gDNA Dispelling RTSuperMix 试剂盒（批号 S8125 ）购自 TianGen 公司、 Green qPCR SuperMix 检测试剂盒（批号 N41217 ）购自北京全式金生物技术有限公司；白细胞介素 -6 （ interleukin-6 ， IL-6 ）、白细胞介素 -1β （ interleukin-1 β ， IL-1 β ）、肿瘤坏死因子 -α （ tumor necrosis factor-α ， TNF-α ）、甘油醛 -3- 磷酸脱氢酶（ glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase ， GAPDH ）引物由上海英潍捷基公司合成。

1.6.4 仪器 1300 series A2 细胞恒温培养箱（ Thermo Fisher Scientific 公司）；多功能酶标仪（ PerkinElmer 公司）； QuantStudio 5 荧光实时定量 PCR 仪（美国 AB 公司）。

1.6.5 枸杞子提取物对碘酸钠诱导的 ARPE-19 细胞活力的影响将处于对数生长期的 ARPE-19 细胞以 4 × 10 ⁴ 个 /mL 接种于 96 孔板，于 37 ℃、 5% CO ₂ 培养箱中培养 24 h 。设置对照组、模型组、枸杞子不同部位药物（ 1 、 3 、 10 μg/mL ）组，模型组和各给药组加入碘酸钠（ 1.3 mg/mL ），各给药组另加入相应药物，对照组加入不含药物的 10% FBS DMEM/F-12 培养基，培养 24 h 。每孔加入 MTT （ 500 μg/mL ）溶液，孵育 4 h ，弃去上清，每孔加入 150 μL DMSO ，于 37 ℃摇床孵育 30 min ，于 570 nm 处检测吸光度（ A ）值。

1.6.6 枸杞子提取物对脂多糖诱导的 BV2 细胞中炎症因子表达的影响将融合度为 70% 的 BV2 细胞以 4 × 10 ⁵ 个 /mL 接种于 6 孔板中，培养 24h 。设置对照组、模型组、枸杞子不同部位药物（ 1 、 3 、 10 μg/mL ）组，模型组和各给药组加入脂多糖（ 1 μg/mL ），各给药组另加入相应药物，对照组加入不含药物的培养基，培养 2 h 。以磷酸盐缓冲液洗涤 2 遍后，按照 Trizol 试剂盒说明书提取细胞总 RNA 后，按照试剂盒说明书制备 cDNA ，进行 qRT-PCR 。引物序列： IL-6 上游引物为 5’-CGTCACACATCCCGTCAG-3’ ，下游引物为 5’-GGATGAGGGATGCCAGTTG-3’ ； IL-1β 上游引物为 5’-TGCTGAATCCAAGCCTCTG-3’ ，下游引物为 5’-TTTAATGCAACTTCCCTT-3’ ； TNF-α 上游引物为 5’-GGATCCTGCACATGGGTAC-3’ ，下游引物为 5’-CTGTTCCTCCAGGTCGATG-3’ ； GAPDH 上游引物为 5’-GACGCTGCTCATCCCACTA-3’ ，下游引物为 5’-CCACCTGGTCCTCATCGTT-3’ 。

1.7 数据处理

实验数据以表示，采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行分析，通过单因素方差分析及 t 检验进行各组间差异比较。

2 结果

2.1 枸杞子活性成分的筛选

通过 TCMSP 数据库得到枸杞子活性成分 36 个，删除重复值后共 35 个。通过检索国内外文献得到枸杞子活性成分 265 个 ^[15-23] ，合并 2 次检索信息，删除重复值，共获得枸杞子活性成分 287 个，其具体类型及分布见图 2 。

2.2 潜在靶点预测

将上述活性成分的结构导入 SwissTarget Prediction 平台预测靶点，共获得靶点 1133 个。可能性值越高表明该靶点可信度越高，根据靶点的可信度，取可能性≥ 0.5 的 126 个靶点进行下一步分析。通过 TCMSP 数据库获得 194 个靶点，合并 2 次检索信息，删除重复值，共获得枸杞子靶点 444 个。从 Genecards 数据库获得 AMD 靶点 3021 个，疾病靶点度值最大值为 156.59 ，最小值为 0.23 ，取其 2 倍中位数，设定相关度大于 6.47 的靶点为 AMD 的潜在靶点。结合 OMIM 、 TTD 、 DrugBank 数据库相关靶点，整合并删除重复值，经 Uniport 数据库规范化后得到 553 个疾病靶点。利用 Venn 作图取交集，如图 3 所示，得到 80 个枸杞子改善 AMD 的潜在靶点。

2.3 PPI 网络分析

将从 String 数据库获得的靶点 PPI 图导入 Cytoscape 软件，通过 MCODE 聚类分析功能得到核心子网络，如图 4 所示，靶点度值越大，形状越大，表明靶点与网络中其他靶点连接越紧密。 VEGFA 、白细胞介素 -8 （ interleukin-8 ， IL-8 ）、 IL-6 、 TNF 、基质金属蛋白酶 -9 （ matrix metalloproteinase- 9 ， MMP-9 ）等排名靠前的靶点为枸杞子改善 AMD 的核心靶点。

2.4 GO 富集分析和 KEGG 通路分析

2.4.1 GO 分析利用 Matescape 平台对枸杞子调控 AMD 的潜在靶点进行 GO 分析，枸杞子主要通过参与调节对无机物的反应、对有毒物质的反应、活性氧代谢过程、对氧化应激的反应、细胞因子介导的信号通路等 1816 个生物过程发挥改善 AMD 的作用，将 P ＜ 0.001 排名前 10 的条目运用 R 语言绘制气泡图，如图 5 所示。

2.4.2 KEGG 分析利用 Matescape 平台对枸杞子调控 AMD 的潜在靶点进行 KEGG 分析，枸杞子主要通过参与调节流式剪切应力与动脉粥样硬化通路、晚期糖基化终末产物（ advanced glycation end products ， AGE ） - 晚期糖基化终末产物受体（ receptor for advanced glycation end products ， RAGE ）信号通路、癌症通路、白细胞介素 -17 （ interleukin-17 ， IL-17 ）信号通路、 TNF 信号通路、缺氧诱导因子 -1 （ hypoxia inducible factor-1 ， HIF-1 ）信号通路等 135 个通路发挥改善 AMD 的作用，将 P ＜ 0.001 排名前 10 的条目运用 R 语言绘制气泡图，如图 6 所示。

2.5 “ 药物 - 成分 - 靶点 - 通路 - 疾病 ” 网络

通过 CytoScape 3.7.2 软件构建“药物 - 成分 - 靶点 - 通路 - 疾病”网络，如图 7 所示，该网络共有 180 个节点（包括 1 种药材、 88 个活性成分、 80 个靶点、 10 条通路、 1 个疾病）。拓扑分析结果如表 1 所示，槲皮素、杨梅素、谷氨酸、 β- 胡萝卜素、桑色素等节点度值排名靠前，可能为枸杞子中的主要活性成分。

2.6 枸杞子提取物对碘酸钠诱导的 ARPE-19 细胞活力的影响

如图 8 所示，与模型组比较，各质量浓度的枸杞子 95% 乙醇部位均可显著升高 ARPE-19 细胞活力（ P ＜ 0.001 ）， 70% 乙醇部位次之（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ），此外， ST 低剂量组和 SC 中剂量组可显著提高 ARPE-19 细胞活力（ P ＜ 0.05 、 0.01 ），表明枸杞子 95% 和 70% 乙醇部位对碘酸钠诱导的 ARPE-19 细胞损伤有较好的保护作用。

2.7 枸杞子提取物对脂多糖诱导的 BV2 细胞炎症因子 mRNA 表达的影响

如图 9 所示，与对照组比较，模型组 BV2 细胞中 IL-6 、 IL-1β 和 TNF-αmRNA 水平显著升高（ P ＜ 0.001 ）；与模型组比较， ST 中、高剂量组及 SC 低剂量组及 SS 中、高剂量组、各剂量 SBW 组及 30% 乙醇部位低、中剂量组及 70% 乙醇部位低、中剂量组及 95% 乙醇部位各剂量组均能显著下调 BV2 细胞中 IL-6 mRNA 水平（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ）； ST 高剂量组、 SC 低剂量组、 SS 高剂量组、 SBW 高剂量组及 70% 乙醇部位中、高剂量组及 95% 乙醇部位中、高剂量组均能显著下调 BV2 细胞中 IL-1β mRNA 水平（ P ＜ 0.05 、 0.01 、 0.001 ）； ST 低、高剂量组及 SC

基于“成分-靶点-通路”的枸杞子调控年龄相关性黄斑变性作用机制研究

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