现在已经证明免疫系统可以控制和清除癌细胞。在免疫经常受到损害的患者中，获得性T细胞转移能够和有目的性的疫苗一起突破限制。作为治疗癌症的基因工程改造物质，它结合了基因工程和分子生物学的特点，目的是产生新的功能加强的生物结构，这篇综述的主要内容讲的就是这一方面。不同设计的抗原受体、生产过程和研究人群，已经在临床实验中检测并公布了。虽然基因工程改造后的T细胞还有很多待解的问题，但是鼓舞人心的缓解率为我们进军癌症和慢性感染提示了一条光明大路。

众所周知，免疫系统分为细胞免疫和体液免疫，体液免疫可以诱发肿瘤自然免疫反应的机制。 然而，在大多数情况下，疫苗不能诱导建立肿瘤排异反应。过继性的T细胞表达，Billingham等人创造的术语 ，具有能够克服与疫苗相关的显著差异性潜力，特别是要求从头激活和扩大肿瘤抗原特异性T细胞反应患者，这些患者经常受到免疫损害。Mitchison首先报道了癌症的靶向性， 50多年前他在啮齿动物模型中发现了过继转移淋巴细胞。

用于癌症的新兴的工程生物学，结合了遗传工程和分子生物学的特点后，创造了新的具有扩增功能的生物结构，这是本篇文章的重点。 1989年，Eshhar和同事报道了第一个在淋巴细胞中表达的合成受体。 不久之后，欧文和韦斯报道包含CD8的嵌合抗原受体（CAR）和CD3ζ链足够激活T细胞。结合过继性细胞治疗的基因转移原理可以联合中枢和外周的耐受性来攻克细胞功能上的限制，使肿瘤抗原得到高效表达。

在大多数患体内存在许多可以消除肿瘤组织免疫调节机制 。 与外来抗原相比，最大的问题是自体抗原和T-细胞受体（TCR）的亲和力相对较低。比较分析显示，识别自体肿瘤抗原的T细胞的表面受体大多对组织相容性复合体（MHC）具有较低的亲和力：肽复合物与其病毒特异性TCRs存在差异。使用设计的获得性转移TCR和CAR是克服这个障碍的希望之路（图1）。携带内源性TCR的T细胞过继性表达可以有效的治疗病毒介导的肿瘤。Rooney和他的同事报道说，由肿瘤联合病毒引起的肿瘤碎片会持续增加。由于细胞巨化病毒（CMV）似乎可以感染神经胶质瘤，所以临床上将CMV-特异性T细胞作为一种潜在的治疗方法。

图1：编辑为具有肿瘤靶向性T细胞。通过引入基因重新编码所需的肿瘤特异性和亲和性T细胞受体（TCR）和嵌合性抗原受体（CAR），使其产生特异性的T细胞。在非限制性MHC中，CAR可以靶向识别表面抗原。即使内生的TCR被各种方式被敲除，T细胞依然可以表达这种受体。Costim，cosignalling域如CD28，ICOS或4-1BB; LAT，链接激活的T细胞; scFv，单链可变片段; ZAP70，ζ链结合相关蛋白激酶70 kDa。

尽管采用抗逆转录病毒疗法（ART），慢病毒载体医疗和经济成本高，因此在HIV-1治疗中还存着 不足。 设计的T细胞治疗艾滋病毒的载体是产生可以抵抗HIV-1感染的免疫系统，控制病毒复制低于检测下限，在没有ART的情况下也能具有较高的功能。最近的技术，包括概念和临床试验的进步使得HIV-1治愈显的触手可及。近期， 我们的小组将锌指核酸酶注入到HIV-1感染患者体内，转化的CD4 T就可以抵抗CCR5的吞噬。这些被修饰的T细胞不仅可以在ART干扰期间存在，而且也可以在体外的HIV-1型空白组中存在。在Sangamo Biosciences提供的未发表的后续研究中，对照组中有两名HIV-1患者表达ART，一个维持对照48周。

从肿瘤组织和体外扩展实验中收获的侵袭性转移肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）首次被国家癌症研究中心的一个小组用于肿瘤抗原特异性T细胞扩增培养。Hinrichs＆Rosenberg报道说，这种扩增方法成功与否受许多因素影响，包括培养技术、宿主自身的放疗化疗状况。用于过继性表达的TIL培养通常是通过短期的体外扩增和筛选抗肿瘤活性来传代的。TIL获得途径主要是通过黑色素瘤的位点来评估的，部分原因是长期以来，黑色素瘤一直被当作是“免疫原性”肿瘤。已有证据显示在晚期转移性黑色素瘤患者中，TIL治疗可以维持持久的抑瘤活性。Linnemann等人观察到，TIL治疗患者作用机制是T细胞共享新抗原的结果，特异性抗原是由肿瘤特异性突变或替代开放型阅读框编码的表达位点产生。初始数据表明，与抗共同的自身-抗原的T-细胞反应相比，某些抗特异性-抗原的T细胞反应具有更高的反应数据。我们认为，制约TIL治疗广泛使用的主要问题就是高剂量IL-2和输液带来的毒性。第二个障碍就是肿瘤收获和TIL培养中的工作人员的目的性，这些因素制约研究人员开展随机临床实验分析。

嵌合抗原受体CAR通常包括三个不同的区域：细胞外靶标结合区域，锚定CAR将其带入细胞内膜的跨膜区和细胞内信号传导区。细胞外目标结合区域通常来源于从抗体中分离的scFv决定簇，这个抗原决定簇通过一个单链连接在多肽序列上。跨膜区域通常源自T-细胞反应中所涉及的一些分子，如CD8和CD4受体分子。Chmielewski等人都很关注CAR在临床试验中的结果。基于CAR策略的主要优势是目标结合部分源于抗体，这些抗体对于一些序列的亲和力比TCR高。另外，因为CARs能够识别完整的细胞表面抗原，在接近和提呈目标位点时标靶细胞不受MHC限制。因此，以CAR为基础的方法对由MHC限制性相关的肿瘤逃逸机制不敏感。在这一点上，很多研究表明CAR T细胞在B-细胞系血液恶性肿瘤中具有强大的抗肿瘤作用。这一领域 最大的问题是这种方法是不是可以扩展到非B-细胞恶性肿瘤，特别是可不可以用来治疗癌症。

在CAR战略中，不论是理论还是实际应用，存在很多的限制和挑战性。在实际应用中，CAR方法的局限是标靶细胞表达决定簇，即在异源物种中产生抗体。另外，因为CAR是一种由具有特异性连接片段的组合区域合成的分子，所以CAR-改造的T细胞有理由成为患者体液免疫和细胞免疫的潜在目标，这在临床上是被默认的，在极少数情况下会引起过敏反应。就理论限制而言，合成的CAR是用来传递TCR和共刺激介导的信号，这种信号不同于天然信号发生过程中生理性的复合体，由CAR引起的信号级联反应会在定性和定量上区别于由天然TCR信号引起的这些反应。这可能会导致反向的作用，比如淋巴组织不可控性增生，庆幸的是这种事件还没有发生。然而，CAR中非生理性信号区域也会产生一些有益的作用。举例来说，CAR T细胞不太易感，因此，可能在肿瘤微环境中具有改善的功能。Abken和同事共建了一个灵活的途径来标靶肿瘤基质：编码CAR T细胞用来分泌转基因细胞因子，然后富集跟随获得性免疫之后出现的先天免疫中出现的细胞因子，如IL-12。

从CAR T细胞具有一定量的毒性。 这些包括B细胞发育不良，细胞因子释放综合征，巨噬细胞活化综合征和神经系统疾病毒性。 神经系统毒性的原因是未知的，但可能是针对CD19的药物的效应，因为单抗可见 。近来，细胞因子释放综合征的治疗已被审查。

20多年前就已经能够通过TCR的α和β链将T-细胞特异性转移至原始T细胞内。从患者和健康人体内提取扩大培养的肿瘤-抗原-特异性T细胞一直是提取肿瘤-特异性异二聚体TCR的主要来源，多年来，人们想尽办法从多肽和全抗原角度去增值这种T细胞。因为在全血中这种T细胞的含量较低，缺乏高效的培养增值方法加之方法分离困难重重；此外，这样的T细胞通常具有较低的亲和力和较弱的抗-肿瘤活性。目前已经开发了很多方法客服这些困难，其目的是能够产出更高的肿瘤抗原-特异性T细胞。其中一个从本质上克服TCR对自体-抗原低亲和力的方法就是通过诱变分离后T细胞的α和β受体链来增强TCR的亲和力。设计出更加完美的分子和高表达基因，这两种途径都可以增加TCR的亲和力，这使得TCR对目标抗原的高亲和力能够稳定的再现。其它方法在增强TCR亲和性的同时减少了TCR链上的N-糖基化。

Hinrichs/Rosenberg和Ruella/Kalos宣称，通过多种方法使 T细胞表达TCR-T，然后用该细胞处理肿瘤，会产生很多预期结果。然而，合成的TCR还存在中靶和脱靶毒性。总体看来，已经能够从HLA-A*0201转基因鼠中收集到表达的TCR- T细胞，转基因表位共享在MAGE-A3，-A9和-A12之间。对九名患者进行对比实验发现，其中的五名患者出现了可见的临床反应，但是有三名患者出现严重不良事件，伴发神经毒性，其中两人死亡。尸检报告显示在死者脑部组织出现了罕见并且从未被识别的MAGE-A12表达产物。近期报道了两个试验证明用增强型HLA-A * 01和MAGE-A3-特异性TCR来标靶黑色素瘤和骨髓瘤。每个试验中的第一位治疗患者都出现了严重的心脏毒性，在细胞输注后的7天内死亡。回顾分析表明亲和力增强型TCR导致了HLA-A * 01-限制性相关表位识别的缺失，这一结果是通过对心肌细胞做蛋白梯度表达测得的。这些实验结果表明带有特异性的获得性转移T细胞的效力和开发改进用于临床前筛选工程化TCR的方法。

引入改造TCR后所带来的潜在毒性是内源性TCR和转基因TCR形成的二聚体产生的。Torikai等人发现，避免涉及TCR基因的最好办法就是编辑锌指结构核酸酶。内源性TCRα和β链的表达用这种方法永久性剔除，其结果就是使转基因TCR和CAR表达提高，功能提升。

有趣的是，从历史角度来看，包括基因重组的获得性细胞转移（ACT）比改进的HIV-1/AIDS要早20年用于治疗，来自AIDS患者的一些治疗的数据可以证实一些在癌症领域中的概念。最初的试验是用来控制HIV-1感染带来的药物耐受性。然而，现在的挑战是开发具有消除HIV感染性的细胞技术。在柏林的Gero Hutert和他的同事成功的治愈了一名HIV患者，他们移植了同种异体造血干细胞（HSC）和源自纯合CCR5 delta32供体，这一事件鼓舞了这一领域中的所有人。 如今通过基因改造ACT标靶HIV-1受体有很多方法可以诱导固有细胞抵抗HIV感染。

除受体外，优化T细胞的效应器功能也可以增加临床疗效。细胞培养方法使效应细胞产生了短暂的分化。近来Kalos和他的同事报道说，CAR T细胞的试验表明临床反应的预测性生物标志反应了输注T细胞的增值能力 。现在人们普遍认为通过TCR刺激T细胞，不带有第二共刺激信号，而基于CAR的生物技术克服了这种缺陷。另外，通过单独的CD3z链作为细胞内转导识别信号的第一代CAR；第二代CAR和第三代CAR结构已经并入共刺激信号结构域，如那些衍生自CD27，CD28，CD134或CD137的结构域。另外，培养体系通过固定配体共同刺激后提高了获得性转移T细胞的功能。

现在最重要的讨论就是确定用于输注的最佳细胞产品。问题是选择供培养用细胞亚群和随后的基因工程T细胞是否需要纯化，或者说，可以允许大量使用包含CD4+辅助细胞、CD8+毒性细胞、幼稚型细胞记忆细胞、效应细胞和其他亚型的细胞混合物例如，可以优化细胞培养条件，使用抗-CD3和抗CD-28， IL-7和IL15来提高T-central记忆细胞的表达。Fowler说，在培养过程中封锁（mTOR）的信号通路可能会增加后天治疗的效果。用雷帕霉素蛋白酶和其他mTOR激酶抑制酶来控制新陈代谢路径，这样可以改变获得性转移T细胞的功能和活性 。此外，临床前期模型中，编码mTOR的雷帕霉素-突变体的CAR T细胞能够增强其抗肿瘤作用。已有报道发现具有干细胞样性能的T细胞，然而，这种细胞是否优于记忆细胞或者幼稚型T细胞还未可知。Ghosh等人专注于开发基于T细胞的免疫疗法来治疗同种异体HSC移植。他们指出很多研究表明“关闭“细胞可以跨越MHC屏障，特别的是前体T细胞的获得性转移可以增强异体移植干细胞后的T细胞重建作用。

临床过继细胞转移治疗的一个主要问题是避免输注衰老状态细胞。在小鼠模型中没有预测到这个问题，因为端粒生物学在小鼠和人类免疫系统之间很大差异。同TIL治疗，黑色素瘤患者在接受细胞转移治疗后，转移淋巴细胞的端粒长度与在体状态和肿瘤回归有关。CD28共刺激可以增加端粒酶活性从而增强体外培养中的端粒长度。Gschweng等人发现，解决这一问题的办法是使用HSC或诱导多能干细胞。另一种防止培养过程中发生终端分化的办法就是不让细胞发生效应分化。Crompton等人发现了在机体免疫反应中产生分化的细胞机制，他们提出使用生物合成表达基因可以抑制分化的发生。

在细胞回输过程中存在一个潜在的安全隐患，就是工程T细胞是由病毒整合插入基因产生诱导表达的，这已经在HSC基因工程中得到证明。Cooper说，这个问题可能会伴发非病毒的集成。在先天性和获得性免疫缺陷患者中发现，在获得性转移后，改造后的基因在T细胞能够持续存在至少10年以上，而且没有副作用，这说明从功能上来说，基因修饰人类成熟T细胞是安全的，至少部分安全，因为慢病毒整合位点不是随机的，更适合原癌基因。此外，在TCR方面，T细胞不像B细胞，它受制于克隆竞争，这或许能够解释T细胞白血病较低的发生率和T细胞在发生转型时出现的相对抗性。

这一研究领域中的另一个重大问题就是如何控制过继T细胞的寿命。初步尝试引入“自杀基因”如单纯疱疹病毒胸苷激酶（TK）基因;然而，这些尝试面临的问题是在标靶TK衍生序列中出现的免疫排斥。最近建立这样一个系统：在适当条件下，将修饰的人类胱天蛋白酶-9融合到人FK506结合蛋白，使其发生二聚体化，小分子刺激后能输送细胞凋亡信号，就能完美的解决问题，并且已经开始开临床实验中进行。Dotti及其同事、Gottschalk Savoldo、Brenner 和Jensen＆Riddell 已经讨论了调节工程T细胞持续性的方法。

在这次审查中，我们强调了两个基本的基因转染方法来解决T细胞谱的中枢和外周差旁路效应。宾夕法尼亚大学的小组和其他地方近5年的临床资料显示我们正处于过继性T细胞治疗黄金时代的门槛，在治疗癌症方便出现了很多成功案例。最近有报道说，带有CD137和CD3ζ信号域的CAR T细胞具有功能长效性，持久的临床豁免性和持续的B细胞发育不良，这提示过继性T细胞可以具有一个显著的抗肿瘤活性。虽然早期成功了，但是在治疗B细胞恶性肿瘤中如何能够实现其广泛性、重复性和高效性依然存在很多重要的问题，

最近有很多话题都集中在设计原理上。首先，确认最优的过继细胞产物。其次，正在进行的靶向CD19的CAR工程细胞试验中，患者接受工程细胞后期临床治疗至少4年后没有出现复发，而且通过标靶正常的CD9-阳性B细胞也没有发现出现B细胞发育不良，这提示了最终凋亡工程细胞和正常B细胞重建的实际需要。因此，面向这个领域的一个中心问题就是设计和实施不同方法来控制获得性转移细胞的命运。这些发现正在快速的向临床转化，而且在下个十年内，工程T细胞转移将开始建立一个有效的癌症疗法。最后，过继性T细胞治疗的挑战将是是否有必要与其他抗肿瘤疗法结合以及如何能够合理的与其结合。需要特别注意的是，正如Yee所说，我们将会合理的结合疫苗治疗、检查抑制剂、激动性抗体、小肿瘤分子抑制剂和标靶基质来治疗血液瘤。

参考文献：

June CH, Levine BL. T cell engineering as therapy for cancer and HIV: our synthetic future.Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2015 Oct 19;370(1680):20140374.