动力蛋白（灰色）通过高尔基囊泡接头蛋白BICD2（橙色）与动力蛋白激活蛋白（彩色）结合的复合物结构模型。来源：http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/cartera/main.html）
撰文 | 吴 槑
责编 | 陈晓雪
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在生物体内的真核胞内的微观环境中，有一些被称作“细胞骨架”的网状结构就如同城市中四通八达的轨道交通。分子马达（molecular motor）是一类驱动细胞自身或细胞内部的物质运动的大分子复合物。 其中有一类非常重要的骨架依赖的分子马达，被称为马达蛋白（motorprotein），就是沿着细胞内部密集分布但却井然有序的细胞骨架，运输重要的生命货物，充当着细胞里面的交通工具。
这些过程必须严格遵守细胞内的“交通规则”，就像现代的物流系统一样，必须在特定的时间和特定的地点把适量的货物精确运输到另外一些地点，否则整个细胞的“微型社会”就会彻底紊乱。成千上万的马达蛋白分子就是在这些规则的约束下，在如同密密麻麻的复杂网路轨道上穿梭前行，而又有条不紊，为细胞内的物质运输提供了重要分子基础。
动力蛋白（dynein）是一类沿着微管做负向运输的马达蛋白(Carter 2013, Bhabha, Johnson et al. 2016)，早在半个世纪以前就被发现(Gibbons 1963)。但是因其超大的分子量和高度的构象动态特性，一直是公认的难以解析的“硬骨头”。虽然经过世界各地几代科学家多年探索，迄今为止，人们甚至对完整的动力蛋白极低分辨率的三维轮廓图都难以获取。其在细胞内以怎样的方式的自抑制？又是怎样被完全激活？这些问题所涉及到的精细的分子机制就更加然迷雾重重。
最近，利用冷冻电镜（cryo-electronmicroscopy, cryo-EM）单颗粒重构技术，英国MRC分子生物学实验室（MRC-LMB）的Andrew Carter实验室解析了人源动力蛋白phi-颗粒（phi-particle）状态的结构，并与其德国合作者证明phi-颗粒代表了动力蛋白在细胞质中的自抑制状态。同时该实验室也获得了难度更大的具有37个不同大小亚基的DDB三元复合物中等分辨率结构，结合一系列生物化学和生物物理实验系统而全面地揭示了动力蛋白如何从自抑制状态转化为激活状态的两重精细调控机制，动力蛋白由此具有了长距离运输物质的能力。
6月8日，《细胞》（Cell）在线发表了这一结果。论文上线当天，笔者联系到了Andrew实验室的博士后研究员，本篇论文的第一作者张凯博士，听听一线科学家讲述动力蛋白背后的研究“动力”究竟源于何处。
《知识分子》：马达蛋白在生物体内是起到运输作用的重要执行者，一直是细胞生物学和结构生物学研究的热点。其中，动力蛋白的结构研究更是因为其难度极高而引人瞩目。你们是如何开始动力蛋白的研究的？
张凯：动力蛋白是一类骨架依赖的分子马达，通常沿着微管做负向运输，在生命体的基本活动，比如细胞分裂中的纺锤体形成和染色体排列、细胞极性、胚胎发育、神经系统中的囊泡运输、线粒体和高尔基体等细胞器的分布、蛋白质（包括变性聚集蛋白质）和mRNA等生物大分子的定位、细胞内吞作用、病毒侵染等等过程中，都起到了非常重要的作用。
动力蛋白分子量巨大、构象复杂，相比其它骨架依赖的马达蛋白，如驱动蛋白（kinesin，和动力蛋白相反，主要沿着微管做正向运输，少数例外），分子量要大将近一个数量级(Carter 2013)。而且，动力蛋白高度动态可变，之前的生化和功能研究(McKenney,Huynh et al. 2014, Schlager, Hoang et al. 2014)已经发现动力蛋白在未结合动力蛋白激活因子时是处于自抑制的构象，不能在微管上作长程运输；只有和其激活因子、接头蛋白，比如BICD2N形成三元复合物（简称为DDB复合物），才处于完全激活的状态。Seeing is believing（眼见为实）。如果能从高分辨率结构层次上直接“看到”动力蛋白高度复杂的调控机制，这将是非常有意义的一件事。我们这项工作正是以此为出发点，试图解释动力蛋白如何自抑制以及如何被激活的精细的分子机制。
《知识分子》：面对如此巨大而又复杂的大分子机器，你们在研究过程中有遇到实验或数据处理方面的困难和挑战吗？又是怎么解决的？
张凯：了解冷冻电镜的研究人员都很清楚，取向优势是电镜三维重构的一个瓶颈。我们解析的自抑制状态下的动力蛋白呈现长棒状，称为phi-颗粒（phi-particle）(Amos 1989)。Phi-颗粒在玻璃态的冰层中有着严重的取向优势，很难“站立起来”，也没有“斜着的”，只有“平躺的”；而平躺的也只有典型的两个方向，其余都是零星分布。此外， phi-颗粒在浓度稍高时就相互叠加，阻碍后续重构，一张照片实际可用颗粒仅十个左右。我们尝试了各种优化取向的办法，比如换缓冲液、拉pH值和盐浓度梯度、添加氨基酸或各种去垢剂等、不同性质的载网在不同条件下亲水处理等各种可能的条件相互组合，都没有明显改善，或者取向虽然解决了但却引入其它更严重的问题，总共筛过的电镜样品就接近两千个。最后我们决定硬着头皮收集大量电镜照片，不算上面提到的激活态的DDB复合物，光phi-颗粒的照片就有上万张，有大量都是手动完成。
MRC-LMB电镜机时异常紧张，一般情况两三个月才轮一天，我们不得不花费很大精力写申请书寻找外源机时，这导致收集的数据成像条件都不一致，对后续的数据处理造成相当大的麻烦。幸好经过多方努力，我们最后还是获得了足够的数据。
处理数据时也遇到了一些困难。动力蛋白具有高度动态特性，呈现极为复杂的多级多尺度构象变换，如同动态弹性网络一样，这种动态特性完全有别于我们简单认为的多个结构域之间的相对刚体运动。如果只是简单的多刚体运动（multibody movement），就像几个钢球组装起来相互旋转移动，这似乎没有任何难度，我们很容易通过一些计算技巧解决。Phi-颗粒状态已经算是动力蛋白最稳定的状态了，但多级多尺度动态特性依旧极其严重，经过多轮多级分类，通过优化局部分类和取向，分别处理动力蛋白的“尾巴”和“马达”两部分，我们才完成了最后的结构解析。但这项工作并没有因此结束，更加复杂的开口状态，目前我们还没有办法直接获得三维结构，现在只是做一些简单的多级二维聚类分析。
《知识分子》: 在新发表的Cell文章中，你们使用了大量的生化和细胞实验来验证基于结构和前人实验提出的动力蛋白的自抑制和激活模型，解释了为什么动力蛋白需要动力蛋白激活因子来协助其运动。能够简单解释一下动力蛋白激活的具体过程是什么样的？
张凯：此前的研究表明，动力蛋白单独在体外实验和细胞质中都存在自抑制现象(Splinter, Razafsky et al. 2012, McKenney, Huynh et al. 2014,Schlager, Hoang et al. 2014, Torisawa, Ichikawa et al. 2014)，也就是说它并不能沿着微管做持续的长距离运输。我们的结构和生化试验已经充分证明了phi-颗粒作为动力蛋白的自抑制状态而普遍存在，但这些试验都是体外的证据；我们德国的合作者通过在体细胞实验，关键性地证明了phi-颗粒的存在对于动力蛋白在细胞内的功能至关重要。开始我们认为，可能只要通过突变体打开phi-颗粒二聚化界面，就能激活动力蛋白。结果有点出乎我们的意料之外，事实上野生型和突变体动力蛋白都必须通过动力蛋白激活因子和BICD的结合才能被完全激活。为了进一步研究清楚这些细节，我们进一步解析了难度更大的三元复合物DDB。我们分析和比较了不同状态的动力蛋白结构，一个关键性的因素就是动力蛋白的尾部结合到其激活因子核心部分平行排列的短纤维结构，这个过程迫使尾部必须顺应这种平行排列的构象；最终这种巨大的构象变化影响了马达结构域的空间取向分布，从而使其能够沿着平行的微管轨道做持续的单向运输。
《知识分子》: 冷冻电镜技术发展惊人，可以说在过去几年引发了结构生物学领域内的革命。你对冷冻电镜技术未来发展动向有什么期待或预测？
张凯：得益于直接电子探测设备和电镜数据处理算法上的改进，冷冻电镜技术在过去几年发生了革命性的变化，其中一个关键性事件就是UCSF华人学者程亦凡教授实验组与其合作者首次解析了3.3埃分辨率的TRPV1结构(Liao, Cao et al. 2013)。目前能够解析的蛋白质的分子量下限和分辨率不断被突破，其重要性已经不言而喻，几乎在各个尺度上已经全面取代了晶体学。至于冷冻电镜还不能完成的更小尺度的蛋白分子，似乎已经没有太多生物学意义了，因为冷冻电镜技术的目标应该是朝着更大更复杂，而不是更小的生物体系去发展。这只是我个人的一个观点。
未来，如何解析高度动态的蛋白质超大复合物在原子尺度完整的功能循环，让静态的结构变成动态的高清电影，看清楚它们在原子层次上动态机理将是冷冻电镜技术发展的一个重要方向。这和动力学模拟有本质区别，因为它将是实实在在的实验结果，意义不言而喻。
另外，冷冻电子断层扫描技术(cryo-electrontomography)也在不断发展，如果在未来能够大幅提高分辨率，对于我们理解更大尺度上的细胞器亚结构信息将产生不可估量的深远影响。因为这项技术涉及的对象不仅限于传统的离体蛋白复合物，而且可以是真正具有“生命意义”的对象，并且能够在化学甚至物理层次上还原生命物质的结构基础。这些方面的研究可能远远超出生物学自身的范畴，必然是一个多学科高度融合交叉的宝藏地带。如果一旦实现亚细胞层面的原子分辨率结构解析的常规化，必然伴随着大量闻所未闻、见所未见的新的生命现象和规律的爆炸式发现，最终从基本的物质层次上解读复杂生命体或许指日可待。
参考文献:
Amos, L.A. (1989). "Brain dynein crossbridges microtubules into bundles." JCell Sci 93 ( Pt 1): 19-28.
Bhabha,G., G. T. Johnson, et al. (2016). "How Dynein Moves AlongMicrotubules." Trends Biochem Sci 41(1): 94-105.
Carter, A.P. (2013). "Crystal clear insights into how the dynein motor moves." JCell Sci 126(Pt 3): 705-713.
Gibbons,I. R. (1963). "Studies on the Protein Components of Cilia from TetrahymenaPyriformis." Proc Natl Acad Sci U S A 50: 1002-1010.
Liao, M.,E. Cao, et al. (2013). "Structure of the TRPV1 ion channel determined byelectron cryo-microscopy." Nature 504(7478): 107-112.
McKenney,R. J., W. Huynh, et al. (2014). "Activation of cytoplasmic dynein motilityby dynactin-cargo adapter complexes." Science 345(6194): 337-341.
Schlager,M. A., H. T. Hoang, et al. (2014). "In vitro reconstitution of a highlyprocessive recombinant human dynein complex." EMBO J 33(17): 1855-1868.
Splinter,D., D. S. Razafsky, et al. (2012). "BICD2, dynactin, and LIS1 cooperate inregulating dynein recruitment to cellular structures." Molecularbiology of the cell 23(21):4226-4241.
Torisawa,T., M. Ichikawa, et al. (2014). "Autoinhibition and cooperative activationmechanisms of cytoplasmic dynein." Nature cell biology 16(11): 1118-1124.
Urnavicius, L.*, K. Zhang*, et al.(2015). "The structure of the dynactin complex and its interaction with dynein."Science 347(6229): 1441-1446.
K. Zhang*, H.E. Foster* et al. (2017).“Cryo-EM Reveals How Human Cytoplasmic Dynein IsAuto-inhibited and Activated.”Cell, http://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(17)30585-8
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