冻干制剂设计中的概念与策略

摘要：为了增强水敏感分子的储存稳定性，常见的做法是采用冻干（冷冻干燥）工艺来制造干燥的玻璃态剂型。冻干工艺在加工过程中并非不会施加压力，而且由于制剂中的成分决定了加工条件的设计，制剂和工艺都应设计得使药物实体，特别是蛋白质分子，在冻干的各个步骤或阶段中能够良好地抵抗压力，即在加工过程中的稳定性、长期储存稳定性以及重新溶解后直至给患者使用前的足够稳定性。理解蛋白质分子的关键属性/缺陷以及辅料的选择和工艺参数的设计是关键，以确保能够生产出具有足够稳定性、质量和商业制造可行性的产品。本章的目标是简要讨论有助于设计稳健制剂和冻干工艺的概念与策略。

1.引言

众所周知，发现和研究确定治疗实体的努力和投资，直到它以确保至少2年货架期并满足患者依从性的正确剂型交付，才能带来充分的回报。随着小分子和大分子新形式的爆发，科学家们在配方它们时面临着越来越多的挑战，以解决这些实体在液态中的边缘稳定性。教条表明，大多数分子的稳定性通常按溶液 < 玻璃态固体 < 晶态固体的顺序增加，这是由于反应物种在固态中的运动越来越受限。冻干（冷冻干燥）作为一种干燥技术脱颖而出，与其他如喷雾干燥、喷雾冻干、真空干燥和超临界流体技术等干燥技术相比，能够提供一种能够增强储存稳定性的固态产品。然而，所有这些技术都有其优缺点，无论是与加工条件、可扩展性、产量还是制造成本（COGM）有关。尽管在生物制药和制药行业中，冻干被认为是稳定水敏感分子的首选技术，但它提出了几个挑战和要求，制剂科学家在着手制剂设计之前必须了解。本章的目标是简要讨论有助于克服这些挑战并设计稳健制剂的概念与策略。

2.冻干产品的要求和期望

冻干工艺的一般要求和期望是生产出具有足够稳定性、质量和商业制造可行性的产品，制剂设计直接影响或间接影响所有这些属性。如上所述，冻干工艺在加工过程中并非不会施加压力，而且由于制剂中的成分决定了加工条件的设计，制剂和工艺都应设计得使药物实体，特别是蛋白质分子，在冻干的各个步骤或阶段中能够良好地抵抗压力，即在加工过程中的稳定性、长期储存稳定性以及重新溶解后直至给患者使用前的足够稳定性。它还应具有低残留水分含量、快速/易于重新溶解和易于给药的特点；并且应与装置（重新溶解套件）兼容。从患者和市场合规性的角度来看，冻干产品的外观也很重要，因此应看起来药学上优雅，无塌陷或回熔；该工艺应高效，即总周期时间应在几天内，通常不超过4–5天，易于扩展，无需“主要设备限制/修改”，并且足够稳健，可以在任何典型生产冻干机上实施。

3.前制剂

通常，制剂开发始于前制剂评估，涉及药物实体的强制降解与物理化学特性分析，其发现旨在指导制剂设计。在生物制品的情况下，药物实体是蛋白质，将其置于适当水平的压力条件下，如高温、极端pH、光照暴露、氧化剂、冷冻和解冻和/或机械压力，该研究的目的有两个。首先，理解和阐明其降解途径，化学和/或物理降解/不稳定性。其次，开发/验证未来制剂开发工作所需的稳定性指示分析方法。此机会还可用于识别初步的关键质量属性（CQAs），随着开发工作从早期阶段向晚期阶段发展，这些属性可能会发生变化。

3.1.强制降解/压力研究

通常推荐用于强制降解/压力研究的条件总结如下 • 温度压力：升高温度（至少比ICH Q1A推荐的加速测试温度高10 °C，且低于最低熔点Tm）。

• 冷冻解冻压力：相关的冷冻和解冻循环（3×）&条件（-40 °C，-20 °C&2–8 °C或室温（RT）） • 低pH和高pH压力：（例如，低于pH 4和高于pH 8，如需要也可结合升高温度，以促进脱酰胺） • 氧化压力：氧化条件（化学试剂，如过氧化氢或相关金属） 对于蛋氨酸 – 叔丁基过氧化氢（t-BHP） 对于色氨酸 – 2,2'-偶氮双(2-氨基丙烷)二盐酸盐（AAPH） • 光照压力：紫外和可见光（例如，使用ICH Q1B规定的条件或根据分子更温和的条件） • 搅拌压力：相关的搅拌条件 为了“从一开始就聪明”，并避免在晚期开发中出现意外和失败，越来越重要的是在候选筛选和选择过程中尽早进行一些这些前制剂活动，以便提前识别缺陷并通过突变解决（如果可能），同时确保分子具有合适的药物特性（例如，可接受的降解概况、高溶解性和低粘度）

3.2.化学不稳定性 

如上所述，在着手制剂开发之前，必须对分子进行强制降解，以了解分子具有何种化学和物理缺陷。所指的化学不稳定性是指涉及双键断裂导致化学修饰的反应，简要描述如下：

氧化 

根据位置，发生氧化的残基主要是蛋氨酸和色氨酸，但偶尔组氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸或酪氨酸也相当容易被氧化。当分子暴露于光照、过氧化物、大气中的氧气或氧化还原活性金属离子（如铁、铜或镍）时，会发生氧化。最强大的氧化剂是羟基自由基和/或活性氧种类（ROS），它们容易与易受影响的氨基酸发生反应。蛋氨酸的氧化导致形成化学修饰的蛋氨酸亚砜，而色氨酸的氧化通过羟基色氨酸中间体形成犬尿氨酸。重要的是要对药物活性物质（蛋白质分子）进行表征，并确定是否存在任何氧化倾向，并相应地解决这一缺陷，因为氨基酸侧链的氧化可能导致蛋白质构象发生变化，影响稳定性、效力（效应功能）并减少血浆半衰期。 

建议在商业初级包装中进行氧化研究，使用已确定的制剂成分，并在暴露于相关的氧化压力条件后进行测试，如过氧化氢、紫外线、相关的LUX小时数和适当过渡金属的相关量。

脱酰胺 

天冬酰胺（Asn）脱酰胺是蛋白质分子中发生的一种化学修饰，通过琥珀酰亚胺中间体，导致形成天冬氨酸（Asp）或异天冬氨酸（iso-Asp）残基。它通过引入负电荷的羧酸代替中性酰胺，从而产生酸性电荷变体。某些序列，如Asn-Gly或Gly-Asn，更容易发生脱酰胺，并且对pH敏感。天冬酰胺脱酰胺更可能在高pH下发生，离子交换色谱、等电聚焦、质谱，如果需要位点识别，则可能需要胰蛋白酶肽图谱（TPM）。Asp异构化更可能在低pH下发生，高通量生物发光分析已用于定量iso-Asp的形成。如果易受影响的天冬酰胺位于结构和/或功能上有影响的位置，则可能影响效力和/或稳定性。

二硫键交换（错配） - 未配对的半胱氨酸残基 

二硫键负责通过连接远处的区域来维持蛋白质在紧凑的三维结构中的稳定性。它们也容易通过水解和氧化降解途径形成非天然二硫键和其他反应性物种。二硫键可以通过氧化在两个相邻半胱氨酸残基上的巯基（-SH）之间形成。蛋白质的自由半胱氨酸巯基可以改变现有的二硫键，导致二硫键交换。这种现象称为二硫键错配，可以在分子内和分子间发生，导致构象变化，从而形成聚集体。

糖基化 

糖基化是一种反应，其中蛋白质、脂质和核苷酸的自由氨基被单糖修饰。在反应过程中，形成了希夫碱、阿马多里产物、各种中间化合物，最终形成晚期糖基化终产品（AGEs）。这一序列也被称为“非酶糖基化”或“美拉德反应”。 

糖基化是最不希望发生的翻译后修饰（PTM）之一，它修饰蛋白质三维装饰并触发其异常。附着在蛋白质上的大亲水性碳水化合物部分已涉及各种生物过程，包括对蛋白质折叠的修饰、调节蛋白质稳定性、寡聚化和聚集以及调节酶活性。

N-末端焦谷氨酸 

N-末端谷氨酰胺环化为焦谷氨酸是一种翻译后或共翻译事件，由谷氨酰胺环化酶大大促进，其中N-末端谷氨酸（Glu）环化形成焦谷氨酸（pGlu）。作为制剂科学家，需要意识到这一修饰在pH 4和8时受到青睐，但在中性pH时较少见；然而，人们认为这种类型的N-末端修饰不会对产品的结构稳定性、效力和安全性产生重大影响。

3.3.物理不稳定性 

与化学不稳定性不同，物理不稳定性不涉及化学键，而是表现为聚集体（可溶性和不可溶性）或片段化或吸附。 

最常见的两种物理不稳定性形式是片段化（剪切）和聚集。只要片段化不是CDR区域的一部分，影响效力/生物活性，通常不是主要问题；然而，聚集无论如何都是高度不希望的。聚集会危及（1）生物功能（效应功能）（2）潜在的免疫原性影响，因为它可以通过打破B细胞耐受性来诱导免疫反应，在体内引发抗体清除机制，形成抗药物抗体（药物中和）以及在“显示单体重复的聚集体”和“触发高效免疫反应的抗原的重复性质”之间画出概念上的平行线 - 由过度活跃的免疫反应引起的细胞因子释放综合征（CRS）。因此，上述缺点使得控制蛋白质/抗体聚集在开发成功治疗药物的道路上至关重要。 

制剂科学家应该意识到，化学修饰，如IgG1 Fc区域中的蛋氨酸氧化，会导致二级和三级结构改变，可以通过质谱、圆二色谱和核磁共振进行评估，在热应力下具有更高的聚集倾向，抗体中的组氨酸可能被氧化并形成共价连接的聚集体，含有未配对半胱氨酸的抗体可能在搅拌过程中通过分子间二硫键形成可还原的聚集体，并且脱酰胺和糖基化促进聚集。最近，据报道蛋白质羰基化与抗体聚集爆发率呈正相关。 

一般来说，聚集有两种形式或途径，即胶体不稳定性与构象不稳定性。

3.3.1.胶体不稳定性 

在这种不稳定性形式中，蛋白质保持其天然状态或构象，但由于其固有属性，特别是蛋白质表面的电荷分布，倾向于聚集。它取决于溶液中分子之间的吸引和排斥相互作用，其中涉及非共价力，如静电力、范德华力、疏水力和水合作用力，导致自关联/松散关联。这些弱溶质-溶质相互作用导致的自关联是蛋白质浓度依赖的，这意味着它只在超过临界蛋白质浓度时自关联，并且是可逆的，即在稀释时恢复为单体。胶体不稳定性或聚集体形成在热力学上是不稳定的，但在动力学上是稳定的（见图1），并且通常伴随着粘度增加和乳光现象。它可以表现为亚微米（可溶性）聚集体、亚可见和可见颗粒或其他相行为。

图 1 自由能与胶体不稳定性

胶体稳定性的指标 

渗透第二维里系数（B22）是一种基本的物理化学属性，用于描述溶液中蛋白质之间的分子相互作用，可能导致聚集，通常用作胶体稳定性的指标，其中以蛋白质-蛋白质胶体相互作用占主导地位。 

静态光散射（SLS）是最常用且已建立的技术，用于实验确定B22。其他技术，如自相互作用色谱（SIC）、膜渗透压仪（MO）和分析超速离心（AUC）也可以使用，并且它们提供同样可比的结果。负的B22值表示净吸引的蛋白质-蛋白质相互作用，这意味着潜在的/倾向聚集体形成，而正的B22值表示总体排斥相互作用，这意味着稳定。 

广泛用于评估/衡量胶体稳定性倾向的另一个参数是扩散相互作用参数，Kd。它由扩散系数与浓度的线性关系的斜率表示，并且可以通过动态光散射以高通量方式进行测定。如果由于蛋白质-蛋白质距离减小，扩散系数随蛋白质浓度增加而增加，则表明排斥相互作用。当由于蛋白质-蛋白质距离减小，扩散系数随蛋白质浓度增加而减少时，可以怀疑吸引相互作用或聚集倾向。这一概念如下图示意（图2）。

图 2 互扩散系数与蛋白质浓度的关系

它们通过哈丁和约翰逊方程相关联。

其中 M 是摩尔质量，ks 是沉降速度的一阶浓度系数，ν 是部分比容。其他技术，如乳光、小角X射线散射（SAXS）以及利用电泳迁移率原理测量净电荷的技术，例如毛细管区带电泳（CZE）、膜限制电泳（MCE）以及一种称为大规模并行相分析光散射（MP-PALS）的新技术、Wyatt的Mobius迁移率仪器以及利用电泳光散射测量有效表面电荷势（zeta电位）的技术，有助于理解电荷分布/胶体稳定性，最终了解聚集倾向。

3.3.2.构象不稳定性

构象不稳定性，定义为蛋白质分子折叠和展开状态之间的自由能差异，是由于界面变性、剪切应力和溶液条件导致疏水相互作用而形成非共价不可逆聚集。与胶体不同，这是一种非天然聚集，意味着构象扰动导致部分或完全展开是先决条件，并且由外部条件触发。它在热力学上是稳定的，但在动力学上是不稳定的，这意味着它会随着时间增长。它不依赖于蛋白质浓度，本质上是不可逆的，并不一定伴随着粘度的增加。它是由外部因素引起的，这些因素包括溶液条件（pH、离子强度、温度等）和加工条件，后者包括界面（即空气-水、冰晶-溶液、中间/产品接触表面）、冻融、机械应力（空化、剪切）、环境光、温度和时间。可以使用各种生物物理技术，如圆二色谱（远紫外区190-250 nm用于二级结构和近紫外区250-350 nm用于三级结构）、分析超速离心/沉降速度实验用于高级别聚集、差示扫描量热法（DSC）、MicroCal用于熔点/热转变中点（Tm），作为各种溶液和加工条件的函数来评估和评价构象稳定性。含有芳香环的残基（如色氨酸）的固有荧光取决于整体三维结构和周围环境。当蛋白质因化学或物理应力导致展开时，疏水基团暴露出来，这总是会导致荧光强度的变化和发射最大值的位移。差示扫描荧光法（DSF）利用这一原理已成为分析蛋白质稳定性、热蛋白质展开和熔点分析的高通量方法。展开转变中点Tm（°C），即一半蛋白质展开的点，用作蛋白质构象稳定性的指标。

4.配方开发

在分子可开发性评估的早期阶段，使用计算机辅助软件工具来识别可能易受化学（例如：氧化、脱酰胺位点）和物理不稳定性（如展开（疏水位点）、自缔合（电荷分布）、聚集以及与高蛋白质浓度相关的高粘度）影响的区域，并对分子进行工程改造以减轻这些问题。由于这种策略有助于缓解问题，但并不总是能够完全消除风险，因为某些残基可能是CDR区域的一部分并需要生物活性，因此需要进行配方开发。

4.1.配方的合理设计

配方开发是选择和优化溶液条件和加工条件与辅料的相互作用。因此，配方开发工作的总体目标是确定最终药物产品组成、初级容器配置的最佳条件，以维持药物在药物物质、药物产品通过各种单元操作以及给药至患者过程中的稳定性、安全性和有效性。由于翻译后修饰、化学修饰/不稳定性以及物理不稳定性最终导致聚集的形成，因此理解蛋白质聚集的机制或蛋白质如何聚集是配方开发的核心。Christ Roberts等人提出的以下示意图提供了导致聚集形成的各种途径的见解（图3）。

4.2.减轻风险和蛋白质聚集的策略

根据上述方案，总体策略将是针对聚集阶段1、2和3的构象稳定性/非天然聚集，其中蛋白质展开和成核是聚集的关键步骤，以及阶段1的胶体稳定性/天然状态聚集。减轻聚集的相应方法将是：

• 稳定天然单体，即降低折叠的自由能（GF）或使部分展开的单体不稳定，即增加展开的自由能（GU），以减少阶段I蛋白质展开的潜力；

• 改变蛋白质表面电荷分布，以增加阶段II中展开单体与天然单体之间的电子排斥；

• 打扰阶段III中展开单体的结构重排，以不利于疏水接触和β折叠的堆积。下面提出了配方设计的分步方法。

步骤1：定义商业目标产品概况

编制目标产品概况（TPP）是产品开发的第一步，因为它定义/总结了产品属性或规格，并描述了最终用户将如何使用该产品。它是新药/生物制品/设备的开发和战略管理中的一个重要工具，并且应由参与产品开发的公司所有部门共同准备。它是一个“活文档”，随着知识和经验的增加而发展和成熟，FDA强烈倡导使用TPP，尽管它并不强制要求。可以使用表1中所示的常见模板来为进入开发的每种产品以及现有药物/生物制品的每种新适应症组装TPP。

步骤2：选择pH值和缓冲剂种类

在定义TPP之后，筛选和确定最佳pH值、缓冲盐和离子强度是一项重要的研究，因为它们影响蛋白质溶液的溶解度、稳定性和粘度。随着溶液pH值远离等电点（pI），溶解度增加。通过常用软件如ExPASy或Sednterp，或通过使用Zetasizer Nano ZSP等仪器进行zeta电位测量，从原序列确定单克隆抗体的pI。溶液pH值改变蛋白质表面电荷，并可能干扰维持天然折叠结构所需的有利静电相互作用。溶液pH值还影响化学降解的各种途径，如图4所示。

图 4 反应速率与 pH 的关系 - 深色表示在指定 pH 范围内反应速率更快

建议在4-7.5的pH值范围内进行研究，增量为0.2-0.5单位，以确定最佳pH值，同时保持其他配方成分不变。在选择缓冲剂种类/盐时，配方科学家需要考虑以下因素：选择pKa值接近所需pH值的缓冲剂种类将提供更高的缓冲容量，并且需要更少的量，15-25 mM的范围可能就足够了。少量的缓冲盐可以防止降低塌陷温度，并且也可以防止增加总固体含量，这两者都有助于冷冻干燥过程。• 在选择缓冲盐时必须谨慎，因为在冷冻过程中（容器或小瓶冷冻干燥过程中的批量冷冻融化）选择性结晶出较不溶的缓冲成分（酸或碱）可能导致冻浓缩液中的pH值发生巨大变化，这比在未缓冲系统中获得的变化要大。图5描绘了缓冲盐的物理状态（无定形或结晶）作为温度的函数，图6显示了pH值变化程度作为温度的函数。

图 5 冷冻和解冻过程中一些常见缓冲液的结晶潜力

图 6 由于缓冲盐结晶导致冻结过程中 pH 值的变化

有趣的是，常用的缓冲盐如磷酸盐、柠檬酸盐和组氨酸会发生pH值变化，其中磷酸盐的变化最为显著。磷酸盐缓冲系统由于碱性缓冲成分Na2HPO4·2H2O的结晶，pH值显著下降约4个单位。相反，磷酸钾系统仅显示出适度的pH值增加，约为0.8个单位（图7）。

• 缓冲成分在冷冻过程中结晶的原因是由于温度降低导致溶解度降低，从而导致过饱和，结果溶液中析出晶体。避免使用会结晶的盐。如果没有其他选择，使用少量的盐，这将不会导致结晶。例如，少于30 mM的磷酸钠缓冲液倾向于结晶，并且pH值不会发生变化。磷酸钠缓冲液的另一种选择是使用钾盐代替钠盐，这倾向于消除或减轻问题。

• 已经观察到，当使用醋酸钠缓冲液用于冷冻干燥产品时，在填充过程中以及冷冻干燥过程中由于醋酸的挥发性，pH值发生了巨大变化，见表2。

步骤3：选择表面活性剂并确定最佳浓度运输应力、空气-水界面以及蛋白质与玻璃或硅化表面的相互作用会导致生物分子/抗体的表面变性，从而导致亚可见颗粒的形成和/或聚集，这可能会进一步发展为可见颗粒的形成。应进行系统的振荡研究，该研究涉及使用轨道振荡器，速度为250-300转/分钟，有无硅化玻璃珠（喷涂、擦拭：DOW 360, 1000CSt），添加不同水平的0-2倍量，进行实时和加速稳定性测试；喷涂-烘烤：DOW 365, 1-3%的乳液，烘烤，添加不同水平（0-2倍量）进行稳定性测试）在有无表面活性剂的情况下。该研究应包括筛选各种非离子表面活性剂，如聚山梨酯80和20、泊洛沙姆188（Pluronic® F-68）和泊洛沙姆407（Pluronic® F-127）、聚乙二醇十二烷基醚（Brij 35）和FM 1000，浓度范围为0.0001%至0.1%（w/v）。提出的保护机制可能是由于它们的两亲性（极性头部非极性尾部）、非特异性结合即能量驱动而非相互作用驱动、降低表面张力/能量、优先在界面积累/吸附并作为分子伴侣保持蛋白质的折叠状态。该研究的结果应提供对分子与硅油形成颗粒的倾向的见解，如果是，那么在什么水平？以及确定最佳表面活性剂浓度。文献中没有报告任何特定类型的表面活性剂及其水平有负面影响，但通常作为经验法则，建议从冷冻干燥的角度出发，将辅料的固体含量保持在最低限度。

步骤4：筛选辅料/稳定剂以解决不稳定性/风险

通常，配方除了药物实体外还包含几种成分，这些额外的成分称为辅料。它们被添加到配方中以发挥特定功能，要么是提高稳定性，要么是提高加工性能，它们可能构成冷冻干燥固体的主要部分。原则上，这一步应由前配方数据指导，根据识别出的不稳定性将辅料添加到配方中。

化学不稳定性

脱酰胺和天冬氨酸异构化

天冬氨酸（Asn）的脱酰胺是通过琥珀酰亚胺中间体在蛋白质分子中发生的一种修饰，结果产生天冬氨酸（Asp）或异构天冬氨酸（iso-Asp）残基。脱酰胺和异构化既依赖于pH值也依赖于序列，并且可以考虑使用pH值优化和使用二价阳离子。Asn脱酰胺更可能在高pH值下发生，而Asp异构化更可能在低pH值下发生。脱酰胺反应是碱催化的，并且在pH 5至8之间增加。防止脱酰胺的最佳pH值通常是pH 3-5。异构化反应是酸催化的，通常在pH 4-6下发生，稳定对抗异构化的最佳pH值是pH > 7。由于pH值对溶解度和聚集也有显著影响，建议在开发早期监测脱酰胺，并确定pH值的甜蜜点。

氧化

尽管许多氨基酸如蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸都容易被氧化；然而，蛋氨酸的氧化速度最快且比其他氨基酸更常见。位于CH2和CH3结构域界面的保守重链蛋氨酸残基的氧化会降低热稳定性、Protein A结合、FcRn结合和循环半衰期。CDR中蛋氨酸残基的氧化可能会潜在影响抗原结合，从而影响分子的效力。因此，必须对药物产品中抗体的结构、稳定性和生物活性的蛋氨酸氧化（如果有）的影响进行特征分析。一旦确定这对稳定性和效力至关重要，调查氧化的根本原因，并确定是否：• 仅在静置储存期间发生 • 由金属表面暴露引起 • 由温度诱导的自由基形成引起 • 由辅料的氧化降解产物引起 • 由光照暴露引起。可以采取一些补救措施或措施来解决或预防氧化降解，简要讨论如下。抗氧化剂，如蛋氨酸、亚硫酸氢钠、抗坏血酸、BHT、BHA、亚硫酸氢钠、谷胱甘肽和丙基没食子酸酯，被认为可以作为自由基或氧清除剂，并用于减少注射产品中的氧化倾向。在蛋白质治疗产品中，牺牲性抗氧化剂如蛋氨酸是最常用的辅料。抑制温度诱导的氧化所需的最低有效水平（蛋白质与抗氧化剂的摩尔比）通常观察为蛋氨酸和亚硫酸氢钠分别为1:5和1:25。Genentech集团报告说，蛋氨酸和亚硫酸氢钠的化学计量量足以消除由配方中存在的金属离子和过氧化物杂质产生的自由基引起的rhuMAb HER2的温度诱导氧化，其他例子包括Actemra™和Cosentyx™。像Campath®和Ajoyv®这样的某些产品已经成功使用EDTA作为螯合剂来避免羟基自由基的形成。除了使用抗氧化剂外，用氮气覆盖/填充小瓶的顶空，并对原材料中的杂质，特别是聚山梨酯，实施严格的控制策略，也是常用的策略。

物理不稳定性

如前所述，物理不稳定性可以分为构象不稳定性（部分或完全展开）和胶体不稳定性：

构象

如果由于界面变性或剪切应力，或由于溶液条件导致疏水相互作用而形成非共价不可逆聚集而识别出构象不稳定性，则通常会筛选以下辅料，并且它们在历史上已成功应用于多种产品。筛选排除溶质，如二糖——蔗糖或海藻糖，PEG 400，甘油，山梨醇等，以各种浓度或重量比进行筛选，蛋白质与稳定剂的1:1重量比通常推荐并足够。其有效性应通过其诱导三级结构变化的能力通过圆二色谱谱图和/或通过差示扫描荧光法（DSF）的展开转变中点Tu/Tm（°C）来评估。其背后的保护机制被认为是因为溶质被优先从蛋白质域中排除，增加了展开系统的自由能，从热力学角度来看，这导致折叠形式，因为它将具有降低的自由能。这在图8中以图形方式说明。

图 8 溶质的优先排斥

从冷冻干燥的角度来看，多元醇、山梨醇、甘油和聚乙二醇（PEGs）是不理想的，因为它们具有非常低的玻璃化转变温度（Tg'）值（见表1，“冷冻配方的特性及冷冻干燥属性的确定：案例研究”章节），并且它们显著降低了配方的整体Tg'或塌陷温度。含有这些辅料的配方将需要较长的干燥时间，因为它们需要在非常低的温度下进行冷冻干燥，在某些情况下在商业环境中并不实际可行。二糖如蔗糖和海藻糖是更可取的，因为它们相对具有较高的Tg'值，并且在商业环境中实际可行进行冷冻干燥。从冷冻干燥的角度来看，海藻糖比蔗糖更受青睐，因为它具有以下优势：

1.它比蔗糖具有更高的Tg'和Tg值

2.它作为有效的稳定剂，在广泛的pH范围内（特别是在酸性范围内）不会水解为葡萄糖和果糖，而蔗糖在酸性范围内会水解为还原糖、葡萄糖和果糖，这些可以与蛋白质形成加合物，导致糖基化/美拉德反应或糖的褐变，从而导致蛋糕外观变色。

然而，使用海藻糖的一个缺点是，它的价格是蔗糖的10倍。如上所述，配方设计的主要目标是在实现液体稳定性（至少在室温和2-8°C下维持数周至数月）和冷冻干燥稳定性（≥2年）的同时，谨慎选择辅料，以实现稳定性和加工/可制造性的平衡。 

胶体不稳定性（原生蛋白质-蛋白质相互作用导致自聚集） 

胶体不稳定性可能是由于疏水和静电相互作用，下面将简要讨论。 

疏水相互作用导致非共价聚集 

如果确定胶体不稳定性，且认为其原因是由于蛋白质表面存在的疏水基团之间的疏水相互作用导致非共价聚集，通常建议筛选环糊精。两种常见的环糊精形式，通过溶解作用显示出保护效果的是2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）和磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）。它们的溶解和稳定化效果被认为是因为存在亲水和疏水基团以及它们形成包合物的能力。 

静电相互作用 

当由于蛋白质表面电荷分布不平衡导致吸引作用超过排斥作用时，会发生自聚集，从而形成可逆聚集。 

当存在单一等电点（pI）且pI在碱性区域时，建议将pH调整至离pI 2-3个单位。pH离pI越远，即向低pH方向，单克隆抗体（mAb）携带的净电荷越多，导致分子间更强的排斥静电相互作用，溶解度/稳定性越高。在这种情况下添加任何盐或增加离子强度会使情况更糟，因为它已知会屏蔽电荷-电荷相互作用，从而降低接近能。接近能的降低被认为是胶体不稳定性的原因，从而增加聚集。 

因此，保持低离子强度≤15-20 mM且pH约为5会有所帮助，如图9所示。 

图 10 霍夫梅斯特系列

精氨酸盐酸盐与钠谷氨酸的组合因其在等摩尔比下结合时似乎具有协同效应而受到关注。 

步骤5：填充剂的筛选 

一般来说，填充剂在制药中的预期作用仅仅是作为填充物以增加产品蛋糕的密度，防止产品吹出，增强产品外观，并作为惰性物质，不旨在提供增强药物物质的化学或物理稳定性。有两种情况，配方中加入填充剂会使冷冻干燥更容易和更高效。 

情况1：每瓶药物量极少 

随着更有效药物的出现，无论是小分子世界中的肽类还是大分子世界中的工程抗体（ADCs、DVDs、Diabodies、Bispecific、Fabs等），考虑添加填充剂以缓解与加工、测试和给药系统相关的风险/挑战变得越来越重要。含有1%或更少固体含量的稀释溶液实际上很难在保留蛋糕结构的情况下进行冷冻干燥，因为在初级干燥期间水蒸气的流动可能会对脆弱的蛋糕产生足够的力来破坏蛋糕结构，并可能将一些产品与水蒸气流一起带出瓶子，这种现象称为产品吹出。在这种情况下，加入填充剂变得不可或缺。 

情况2：提高/增强塌陷温度 

配方开发的主要目标之一是通过筛选辅料（缓冲盐和稳定剂）来实现产品在液态和冷冻干燥状态下的理想稳定性。有时，使用具有高塌陷温度的冷冻干燥友好型辅料来实现所需的稳定性是不可能的/不可行的，结果选择了具有非常低塌陷温度的辅料，这将导致长的冷冻干燥周期，并且在商业环境中可能不实际可行。在这种情况下，尽管总固体含量可能足够多，可以在不发生产品“吹出”的情况下进行冷冻干燥，但从冷冻干燥的角度来看，在配方组成中大量添加塌陷温度增强剂是非常可取的，因为它将实现两个目的：（1）显著缩短冷冻干燥周期，（2）增强产品外观。有几种辅料可以作为填充剂，并可以分为无定形和结晶两类。 

无定形填充剂 

一些无定形填充剂，如蔗糖（约-34°C）、海藻糖（约-28°C）、乳糖（约-30°C）和PEGs（约-50°C）不适合用作填充剂，因为它们具有低塌陷温度，因此需要低干燥温度和长加工时间。尽管乳糖通常用作小分子的填充剂，除了其低塌陷温度外，它是一种还原糖，可以与蛋白质产品中的胺形成加合物，必须受到质疑。羟乙基淀粉在临床上用作血浆扩张剂，是一种惰性无定形辅料，具有高塌陷温度（-10°C），可以作为无定形填充剂而无需长加工时间。然而，它被认为在干燥过程中会经历一些蛋糕收缩和开裂，因此可能使蛋糕外观不够优雅。 

二糖，蔗糖和海藻糖通常用作蛋白质产品的稳定剂，并且在药物量少和/或需要调整渗透压以进行皮下给药的情况下也用作无定形填充剂。然而，它们不适合用于增强配方的塌陷温度，因为它们具有低塌陷温度。添加超过稳定蛋白质所需的蔗糖或海藻糖的任何数量都应受到质疑。由于蛋白质的Tg'为-10°C，而蔗糖的Tg'为-34°C，因此明智的做法是使蛋白质浓度/重量比高于蔗糖或海藻糖，因为它已知在浓度>20 mg/mL时开始积极贡献或增强整体塌陷温度。 

环糊精，如2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）和磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）与蔗糖或海藻糖作为稳定剂结合使用时，是良好的无定形填充剂。它们具有高塌陷温度，约为-9°C，并且在大量添加时作为塌陷温度增强剂，增强配方的整体塌陷[63]。对于蛋白质产品，以蔗糖或海藻糖作为稳定剂，以及2-羟丙基-β-环糊精（HPCD）或磺丁基醚-β-环糊精（SBE-β-CD）作为填充剂的配方，将作为冷冻干燥的良好无定形系统，并且具有外观优雅的蛋糕结构。必须注意，为了使塌陷温度增强剂作为塌陷温度增强剂发挥作用，它应该是配方的主要成分，即至少是配方中其他总无定形成分的2倍。 

结晶填充剂 

最常用的两种结晶填充剂是甘露醇和甘氨酸，它们为蛋糕提供结晶基质。为了结晶，它们应该是主要的溶质成分，至少比所有其他溶质成分的浓度总和高出2倍。它们在许多方面优于无定形填充剂，如下所示： 

• 它们具有高塌陷温度（共晶温度），范围在-3°C至-5°C之间，这使得干燥可以在更高的搁板温度/压力下进行，显著缩短冷冻干燥周期。它不会塌陷。 

• 为蛋糕提供机械强度，防止蛋糕在运输过程中变成粉末。 

• 提供外观优雅的结晶蛋糕，易于复溶。

• 使设计具有较大设计空间的稳健冷冻干燥周期成为可能，为技术转移和操作提供广泛的灵活性，见图11。

基于甘露醇的配方除了比无定形系统具有多个优势外，还存在两个潜在挑战；一个与瓶子破裂有关，另一个与形成水合物形式有关，过程工程师应该了解。如果冷冻协议设计不当，无法确保在冷冻阶段完全结晶，则可能发生瓶子破裂。如果甘露醇在冷冻阶段没有完全结晶，它将在初级干燥阶段结晶，因为产品温度上升但仍低于0°C。由于结晶过程是放热反应，并且总是伴随着水的释放，这些水转化为冰，这两个因素都导致玻璃不均匀膨胀，导致瓶子从侧面和/或底部（透镜效应）破裂。 

为了避免瓶子破裂，建议采取以下步骤： 

• 确保首次冷冻温度低于配方的Tg' 10°C，并根据填充体积保持足够的时间以确保形成晶核，然后进行退火步骤（热处理）。退火步骤的最佳时间和温度应通过冷冻干燥显微镜确定，以确保甘露醇完全结晶。 

• 避免高填充深度和高浓度的甘露醇。 

甘露醇倾向于在冷冻阶段形成水合物形式，水合物晶体在≥50°C的温度下脱溶。在作者看来，这应该是一个小问题，因为对产品质量没有实际影响，因为它与晶体晶格结合，并且不是自由水，除非产品暴露在约50°C的高温下，此时它脱溶并释放水，危及产品的稳定性。 

甘氨酸与甘露醇一样效果良好，容易结晶，形成外观优雅的产品，复溶迅速。甘氨酸的一个优势是它不会引起瓶子破裂。然而，甘氨酸蛋糕被认为比甘露醇蛋糕稍微脆弱，通常被认为比甘露醇蛋糕相对不那么优雅。 

甘露醇或甘氨酸基础配方是二元系统，其中无定形和结晶组分共存。稳定剂和其他缓冲物种构成次要的无定形成分，而甘露醇或甘氨酸将构成主要的结晶系统。由于甘露醇或甘氨酸是配方的主要成分，并且代表系统的主体塌陷，产品可以在次要无定形成分的塌陷温度以上和主要结晶成分的共晶温度以下进行干燥。因此，冷冻干燥这种基于甘露醇或甘氨酸的配方相当于具有微观或部分塌陷（即无定形相的完全塌陷）的冷冻干燥，但蛋糕结构由结晶成分维持。在这里，药物形式是无定形涂层在结晶甘露醇上，其稳定性通常接近于没有甘露醇冷冻干燥的系统的稳定性。这使得人们能够在实现优雅外观的同时，实现高效干燥，快速复溶时间和低残留水分含量。

步骤 6：前期可制造性评估

技术转移和制造问题未能成功的主要原因有两个：一是设计配方时未考虑工艺因素，二是设计工艺时不了解制造能力和限制。这两者需要紧密结合，有时责任可能通过配方设计更好地解决，也可能通过工艺条件解决，或者两者结合。因此，配方科学家和工艺工程师必须合作，对配方候选进行前期可制造性评估，尤其是在开发冻干产品时更是如此。

本研究的目的是评估配方候选与制造过程的兼容性，以满足目标产品概况（TPP），并根据需要通过微调配方和/或工艺参数来识别和降低任何风险。应将具有最佳溶液条件的前 2 至 3 种配方候选，使用代表制造条件的缩小模型，经过制造的单元操作（冷冻和解冻、混合、过滤、在不锈钢容器或一次性袋子中存放、灌装、冻干和检查）来评估其可制造性。通常，在实验室规模研究加工条件对分子完整性的影响，这些研究可能会产生误导，因为它们不一定代表或模拟大规模过程。因此，这里建议构建代表大规模单元操作的缩小模型，并使用这些模型筛选配方候选，以识别最佳配方和备用配方。

然后，冻干药物产品瓶应使用运输模拟测试系统（TSTS）进行运输条件测试，之后再进行加速和实时储存稳定性测试。对于每种配方，应分析缩小研究中的过程样品和药物产品样品的相关关键质量属性（pCQAs）。最终的商业配方推荐应基于可制造性评估研究中的可制造性和 6 个月稳定性数据来确定。

5.稳定性测试

5.1.非晶态固体中的降解动力学

其中k是在拉伸时间尺度t上的速率常数，β是一个介于零和一之间的常数。非晶态固体被认为遵循拉伸时间动力学，因为它们由具有不同降解速率的微观状态组成，这些微观状态不在结构平衡中。通常，可以经验地发现，β≈1/2，动力学是“时间的平方根动力学”。

5.2.加速测试条件、温度和时间的选择

在设计加速稳定性研究时，温度的选择对于成功结果至关重要，否则可能会产生误导。研究中的最高测试温度应至少低于干燥固体的玻璃化转变温度（Tg）10°C，同时应足够高，以便在相对较短的时间内产生在产品货架期内产生的降解水平。测试温度与预期储存温度之间的差异不应过大，以免获得非代表性的结果。

如果存在一个系统，其中两个（或更多）降解途径都很重要，但这些途径具有非常不同的活化能，例如一个系统同时发生假设的氧化反应，活化能为 15 kcal/mol，以及假设的脱酰胺反应，活化能为 25 kcal/mol，可能会发现，在加速测试条件下占主导地位的反应在实际感兴趣的温度下甚至并不重要。在高温下，尤其是在 50°C 以上，反应主要是高活化能反应，但在冷藏储存范围内，脱酰胺反应不显著，氧化反应是主导反应。因此，如果使用高温稳定性数据来优化配方，那么优化的反应在预期的 5°C 储存温度下并不显著发生，测试结果可能毫无意义。显然，需要验证在加速测试条件下产生的降解产物基本上与在预期储存温度下产生的降解产物相同，比例大致相当。在项目初期，这充其量是困难的，因此接受基于非常高温度下运行的加速测试条件的预测存在显著风险。从阿伦尼乌斯方程和假设的降解过程的时间依赖性可以估计出加速测试产生与在预期产品储存条件下货架期末端相同水平的特定降解产物所需的时间。图 9 提供了这样的估计，其中对具有低活化能（15 kcal/mol）和高活化能（25 kcal/mol）的反应都进行了计算。当然，具有较高活化能的反应时间更短，而且对于平方根时间动力学的时间也比指数（有效一级）降解动力学的时间短得多。请注意，即使活化能较低，加速测试温度与预期储存温度之间的差异仅为 10–15°C，等效时间也相对较短，特别是对于平方根时间动力学。这是一个重要观点，因为玻璃态系统中的降解通常遵循平方根时间动力学。这一观察的含义是，不一定需要使用远高于预期储存温度的加速测试温度来确保数据的快速周转。然而，也必须认识到，如果目标是产生足够的降解以允许评估精确的速率常数，进而允许定量评估试验配方稳定性的差异，可能需要在加速测试中产生比产品货架期内更多的降解。在这种情况下，时间显然需要比图 12 所示的时间更长。

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