前言：
最常用的
HPLC
分离是反相色谱法，当我们遇到高度极性的样品，不容易在反相色谱保留的样品时，可以采用：
1
可以减少起始的有机相或者使用起始梯度停留；
2
改变流动相的
pH
增强他们的保留（减少分子的离子化）；
3.
在流动相中加入离子对试剂；
4.
使用正相色谱或者
HILIC
色谱法。正相色谱法中色谱柱的极性强于流动相，极性较强的溶质将优先被保留或者吸附在色谱柱上，极性小的先被洗脱除色谱柱。柱保留随着溶质极性的增加而减小。常用的色谱柱有硅胶柱、氨基柱和氰基柱等。重点介绍亲水作用色谱法（
HILIC
）。
亲水作用色谱法（
HILIC
）
亲水作用色谱法（
HILIC
）可以视为使用含水
-
有机流动相的正相色谱法。亲水作用色谱柱比反相色谱柱的极性更强，以极性很强的水为
B
溶剂。增加水的比例会减少样品的保留（与反相色谱法相反），极性较强和电离的溶质在亲水作用色谱中的保留较强。。在大多数的
HILIC
分离中，流动相中水的比例一般为
3%-40%
之间。当水的比例大于
40%
时，保留一般很弱。极性溶质在亲水作用色谱粒优先被保留，意味着反相色谱中保留很弱的物质（
k
≈
0
））可以使用亲水作用分离。它有几个潜在的优势：碱性溶质峰形良好；有助于提高质谱的灵敏度；可以直接进样溶解在有机溶剂的样品（在
RPC
中不合适）。现在几乎所有的亲水作用色谱柱的填料都是键合硅胶。许多
HILIC
分离都采用梯度洗脱。
HILIC
方法的建立：
对于小分子样品而言，反相色谱法的方法建立过程同样适用于
HILIC
。
色谱柱：
首选一根（
100-150
）
mm*4.6mm*3um
的亲水作用色谱柱，首选填料为纯硅胶，次选酰胺基柱。
等度：
初次实验可以采用强度较大的流动性，如
60%
乙腈缓冲盐（乙腈是亲水作用色谱中使用最多的有机溶剂）。接下来可以逐步提高乙腈的比例，每次
10%
，直到满足分离的要求。
梯度：
或者一开始采用梯度洗脱。一般以
3%~5%
的水缓冲盐（
B
）
/
乙腈（
A
），以
40%~60%
水缓冲盐（
B
）为梯度结束条件，梯度时间为
20~60
分钟，流速
1~2ml/min
，柱温：
30~35
℃。
根据分离的结果适当调节时间或者梯度范围，直到满足分离的要求。值得注意的是：在
HILIC
色谱中，
流动相中水的比例一般为
3%-40%
之间。当水的比例大于
40%
时，保留一般很弱。
流动相中应该一直含有一定量的水（
3%~5%
）
缓冲盐：
可电离的化合物分离一般用甲酸、乙酸铵或者甲酸铵为缓冲盐，浓度在
2-20mmol/l
，流动相的
pH
通常为
3-7.
当
pH
增加时，酸性物质的离子化程度增加而碱性物质会减弱。由于溶质电离增加其
HILIC
保留会增加，所以随着
pH
的增加，酸性物质的保留会增加而碱性物质的保留会减少。
HILIC
色谱的常见问题：
在
HILIC
中，最常见的问题是：不理想的峰形（前沿和拖尾）。
解决方法：
1.
增加缓冲液的浓度
2.
如果样品溶解在流动相里面，可以考虑把溶解样品用的有机溶剂的比例增加。
3.
调节流动相的
pH
和更换色谱柱。
结束语：
目前我们所用的色谱分离中反相色谱是最常用的分离色谱法，当反相色谱法无法保留时可以使用
HILIC
色谱法。以上是我对《现代液相色谱技术导论》
HILIC
色谱法的一些总结。请各位同仁指正，欢迎交流。本人
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号：
33455635.
作者：
郭巧灵。
2007
年毕业于南京中医药大学，多年从事药物研发分析工作。目前就职于江苏联环药业股份有限公司。
本文是药群论坛群友郭巧灵的读书笔记，观点仅代表作者本人，如需转载，需经过药群论坛和作者授权！
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，
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