前言：
最常用的HPLC分离是反相色谱法，当我们遇到高度极性的样品，不容易在反相色谱保留的样品时，可以采用：1 可以减少起始的有机相或者使用起始梯度停留；2改变流动相的pH增强他们的保留（减少分子的离子化）；3. 在流动相中加入离子对试剂；4. 使用正相色谱或者HILIC色谱法。正相色谱法中色谱柱的极性强于流动相，极性较强的溶质将优先被保留或者吸附在色谱柱上，极性小的先被洗脱除色谱柱。柱保留随着溶质极性的增加而减小。常用的色谱柱有硅胶柱、氨基柱和氰基柱等。重点介绍亲水作用色谱法（HILIC）。
亲水作用色谱法（HILIC）
亲水作用色谱法（HILIC）可以视为使用含水-有机流动相的正相色谱法。亲水作用色谱柱比反相色谱柱的极性更强，以极性很强的水为B溶剂。增加水的比例会减少样品的保留（与反相色谱法相反），极性较强和电离的溶质在亲水作用色谱中的保留较强。。在大多数的HILIC分离中，流动相中水的比例一般为3%-40%之间。当水的比例大于40%时，保留一般很弱。极性溶质在亲水作用色谱粒优先被保留，意味着反相色谱中保留很弱的物质（k≈0））可以使用亲水作用分离。它有几个潜在的优势：碱性溶质峰形良好；有助于提高质谱的灵敏度；可以直接进样溶解在有机溶剂的样品（在RPC中不合适）。现在几乎所有的亲水作用色谱柱的填料都是键合硅胶。许多HILIC分离都采用梯度洗脱。
HILIC方法的建立：
对于小分子样品而言，反相色谱法的方法建立过程同样适用于HILIC。
色谱柱：首选一根（100-150）mm*4.6mm*3um的亲水作用色谱柱，首选填料为纯硅胶，次选酰胺基柱。
等度：初次实验可以采用强度较大的流动性，如60%乙腈缓冲盐（乙腈是亲水作用色谱中使用最多的有机溶剂）。接下来可以逐步提高乙腈的比例，每次10%，直到满足分离的要求。梯度：或者一开始采用梯度洗脱。一般以3%~5%的水缓冲盐（B）/乙腈（A），以40%~60%水缓冲盐（B）为梯度结束条件，梯度时间为20~60分钟，流速1~2ml/min，柱温：30~35℃。
根据分离的结果适当调节时间或者梯度范围，直到满足分离的要求。值得注意的是：在HILIC色谱中，流动相中水的比例一般为3%-40%之间。当水的比例大于40%时，保留一般很弱。
流动相中应该一直含有一定量的水（3%~5%）
缓冲盐：可电离的化合物分离一般用甲酸、乙酸铵或者甲酸铵为缓冲盐，浓度在2-20mmol/l，流动相的pH通常为3-7.当pH增加时，酸性物质的离子化程度增加而碱性物质会减弱。由于溶质电离增加其HILIC保留会增加，所以随着pH的增加，酸性物质的保留会增加而碱性物质的保留会减少。
HILIC色谱的常见问题：
在HILIC 中，最常见的问题是：不理想的峰形（前沿和拖尾）。
解决方法：1.增加缓冲液的浓度
2.如果样品溶解在流动相里面，可以考虑把溶解样品用的有机溶剂的比例增加。
3.调节流动相的pH和更换色谱柱。
结束语：目前我们所用的色谱分离中反相色谱是最常用的分离色谱法，当反相色谱法无法保留时可以使用HILIC色谱法。以上是我对《现代液相色谱技术导论》HILIC色谱法的一些总结。请各位同仁指正，欢迎交流。本人QQ号：33455635.
作者：郭巧灵。2007年毕业于南京中医药大学，多年从事药物研发分析工作。目前就职于江苏联环药业股份有限公司。
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