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综述:猪病疫苗现状及展望

生命科学前沿 · 公众号 · · 2024-12-31 07:41

正文

摘要： 养猪业已成为全球具有战略和经济双重重要性的产业。然而，这一行业也面临着跨境传播疾病带来的潜在风险，尤其是病毒性感染的威胁最为严重。在众多猪病毒性疾病中，非洲猪瘟、经典猪瘟、口蹄疫、猪繁殖与呼吸综合征、伪狂犬病、猪流感和传染性胃肠炎等对养猪业造成了显著的经济损失。普遍认为，疫苗接种是控制动物病毒性感染的最有效手段。从詹纳和巴斯德时代的早期探索，到现代新一代技术的应用，疫苗的发展显著降低了病毒对动物和人类健康的影响。尽管灭活疫苗和减毒活疫苗为防御主要病原体提供了一定程度的保护，但仍需进一步改良，以更全面地应对新兴感染并确保疫苗的安全性。近期，针对猪病毒的新一代疫苗研究取得了令人振奋的进展，包括DNA疫苗、病毒载体复制子疫苗、嵌合疫苗、肽疫苗、植物源疫苗、病毒样颗粒疫苗以及纳米颗粒疫苗等，这些新型疫苗的开发为猪病防控带来了新的希望。本综述提供了对现有疫苗及猪病毒疫苗未来发展趋势的详尽概述。

1. 引言

根据联合国人口司2019年的数据，预计到2030年全球人口将增长至约85亿，2050年达到97亿，而到2100年将达到104亿。农业用地的减少和全球气候变化使得确保满足人口日益增长的食品安全变得更加具有挑战性。畜牧业在确保食品安全方面可以发挥重要作用，因为基于动物的食品提供了完整的营养和高质量的主要膳食蛋白质。

随着全球人口的持续增长，全球餐食生产和肉类消费量也随之上升。动物蛋白需求的增加使得猪肉，作为主要的蛋白质来源之一，其生产在发达国家和发展中国家的畜牧业中占据了重要地位。最新数据显示，全球生猪存栏量已从2021年的7.5亿头增加到约7.8亿头。中国拥有全球最多的生猪，约4.5亿头，其次是欧盟和美国。人口增长带动了猪肉消费和贸易的全球扩张，但养猪业也面临着众多挑战。传染病是养猪业的一大挑战，每年造成巨大的经济损失，尤其是病毒性疾病，它们导致动物死亡和生产损失。近年来，一些病毒的出现和复发对养猪业产生了不同程度的影响，其中一些引发了严重的临床疾病，而另一些影响较小或可以忽略。养猪业在近年来经历了重大变革，特别是在一些病毒性疾病爆发后，这些疾病引起了全球经济的关注。以中国发生的非洲猪瘟（ASF）为例，它影响了全球近一半的猪群。自2018年中国首次报告ASF以来，到2020年已有超过100万头猪被扑杀，猪肉产量下降了55%。中国此后报告的反复爆发使得情况更加严峻。对1996至2016年间发表的文献趋势进行的综合分析强调了非洲猪瘟（ASF）、经典猪瘟（CSF）、口蹄疫（FMD）、猪圆环病毒（PCV）感染、猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）、伪狂犬病、猪流感和传染性胃肠炎（TGE）是重要的猪病毒性疾病。

疫苗接种被广泛认为是预防病毒性疾病最有效且经济的策略。它能够激发主动的人工免疫反应，促进体液和/或细胞免疫功能。自18至19世纪至今，疫苗技术经历了显著的增长和进步。根据技术发展的时间线，疫苗被划分为三代。第一代疫苗涵盖了完整的生物体，包括灭活和减毒的病原体，它们在控制、预防和根除人类和动物的病毒性疾病，提升畜牧业生产力，以及通过降低发病率和死亡率来促进食品安全方面发挥了关键作用。例如，天花、脊髓灰质炎和牛瘟疫苗就是其中的重要代表。尽管如此，这些第一代疫苗虽然在免疫领域占据主导地位已超过一个世纪，但仍存在一些需要改进的缺陷。第二代疫苗的发展标志着病原体亚单位组分的使用，包括纯化的抗原蛋白、重组抗原和合成蛋白。这一代疫苗技术不依赖于完整的病毒或生物体，而是通过蛋白质表达和纯化平台来生产过量表达的、纯化的抗原。与第一代疫苗类似，第二代疫苗也有其自身的优势和局限，这些因素推动了新型疫苗技术的发展。遗传工程工具的出现和对抗原结构理解的深化为开发第二代和第三代疫苗的铺平道路。第三代疫苗提供了包括DNA、mRNA、基于病毒载体和嵌合抗原在内的多种平台，为疫苗学的进步带来了新的可能性。

分子生物学的进步赋予了我们操控遗传物质的能力，这一能力被便捷地应用于开发新一代疫苗。除了疫苗技术本身，疫苗的递送和注射方式也得到了深入研究。兽医疫苗的发展历史跨越了三个世纪，从18世纪早期的人痘接种试验到最近开发的动物用COVID-19疫苗。这些动物疫苗的产品和重要发展节点如图1所示。

图 1：动物疫苗发展里程碑

2. 疫苗类型

疫苗可以根据其成分或用于其开发的技术进行分类。几种用于对抗猪病毒性疾病的疫苗已经商业化或正在开发中（图2）。

图 2：现有兽用病毒疫苗

3. 全生物体疫苗

历史上，传统疫苗是基于经验试错方法开发的，这种方法模拟自然感染以在宿主中诱导免疫。它依赖于传统的“分离、杀死或灭活和注射”方法，这构成了传统免疫的基础。这种方法使用整个生物体而不是单独的抗原。这种方法也用于那些可以在体外容易培养的病原体。自问世以来，这些疫苗在改善动物和公共卫生方面发挥了关键作用；大多数许可的兽用疫苗仍属于这一类。全生物体疫苗已经成功地针对大多数经济意义重大的猪病毒性疾病进行了测试和使用，包括猪流感、PRRS、伪狂犬病、猪流行性腹泻、PCV感染等。

3.1. 传统灭活疫苗

传统灭活疫苗是最早开发的疫苗之一，由整个被物理或化学手段杀死或灭活的病原体组成，使其不再对宿主具有致病性。这些疫苗是最安全的疫苗类型之一，它们在第二次世界大战后变得重要起来，并开始用于猪身上。这些疫苗的安全性归因于它们在灭活后无法恢复成毒力强的病毒。病毒通常在细胞培养中生长，并使用不同的方法进行灭活。常用的物理灭活方法是热处理，使用热和辐射。另一方面，化学灭活方法通常使用甲醛或β-丙内酯。灭活导致病毒蛋白变性或其基因组受损。尽管灭活疫苗具有更好的安全性和稳定性，但它们有几个缺陷，如短期免疫、细胞和粘膜免疫差、需要加强剂、需要佐剂以及高生产成本。

尽管灭活疫苗有一些限制，但它们对猪病毒性疾病的控制至关重要。多种猪病毒已成为全球严重关注的问题，包括新基因型和血清型的出现。甲型流感病毒（IAV）是一个重要的猪病原体，主要由灭活疫苗控制。使用商业化的全灭活病毒（WIV）疫苗控制猪流感已被证明对基因相似或同源病毒有效。然而，它缺乏对猪流感病毒的异变体和异亚型保护。母源抗体也影响WIV疫苗的效果。使用WIV对抗猪流感的另一个复杂问题是接种疫苗的猪出现疫苗相关呼吸系统疾病。疫苗相关增强疾病（VAED）是在接种特定病原体疫苗的个体随后暴露于该病原体的野生型时观察到的临床感染的变异形式。VAED的经典实例包括非典型麻疹和在接种这些疾病的灭活疫苗后出现的增强型呼吸道合胞病毒（RSV）感染。由于这些WIV疫苗相关的限制，已经尝试使用减毒和新一代疫苗对抗猪流感病毒。

3.2. 减毒活疫苗

减毒活疫苗是应用最普遍的疫苗类型，它们基于传统方法降低病原体的毒力，并将减弱的病原体作为疫苗接种给宿主。在减毒过程中，病毒被传代直到宿主不再显示临床疾病迹象或细胞培养中不再出现细胞病变效应。在过去几十年中，随着各种尖端技术的出现，疫苗学领域经历了巨大的发展。然而，由于它们比其他类型具有许多优势，减毒活疫苗仍然是首选。这些疫苗最适合单剂量和多种给药途径，如肌肉内、皮内、鼻内或口服。减毒活疫苗模拟自然感染，引发强烈的体液和细胞介导的免疫反应，并偶尔出现轻微的临床疾病迹象。它不需要任何佐剂，并提供相对较长的免疫期和低生产成本。然而，安全性和储存是两个重要的问题。减毒病毒恢复成毒力强的形式总是有可能的。活疫苗必须在-80°C下储存或以冻干形式储存，一旦打开就不能储存。与安全性相关的一些主要缺点包括使用的减毒方法是随机和非特异性的，减毒程度不受监管。

合成生物学的进展助力研究人员突破了减毒活疫苗开发中的两大难题。通过计算机算法辅助的合成减毒病毒工程（SAVE），研究人员能够通过引入逆优化的密码子对来下调基因表达。这种逆优化使得病毒以较低的效率合成野生型氨基酸的蛋白质，从而在不充分复制的情况下有效规避宿主的免疫防御。这些经过合成减毒的病毒因其能激发强烈的免疫反应和提供长期保护性免疫而成为疫苗开发的优选。该技术已在猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的快速减毒中得到成功应用，主要通过密码子对优化GP5基因实现。通过体外实验，开发了名为SAVE5的逆优化疫苗，它展现出较低的复制能力和GP5蛋白表达的减少。进一步的体内研究显示，与野生型病毒相比，SAVE5感染的猪在感染后14天内病毒血症水平较低，且肺部的总体和组织学病变减轻。

传统的减毒活病毒疫苗为开发新一代疫苗铺平了道路，但它们仍然用于PRRSV等病毒性疾病。其安全性问题并不常见。然而，2020年丹麦猪爆发PRRS由于两种疫苗株的重组引发了安全性问题。目前商业化的PRRSV减毒活疫苗包括Ingelvac® PRRS MLV和Ingelvac® PRRS ATP (BIVI)，ReproSyc® PRRS EU (BIVI)，Porcilis® PRRS (MSD)，Fostera® PRRS (Zoetis)，Suvaxyn® PRRS MLV (Zoetis)，Prime Pac® PRRS RR (Merck)，Prevacent® PRRS (Elanco)，UNISTRAIN® PRRS (HIPRA)和AMERVAC® PRRS (HIPRA)（表1）。一种NS1截短的双价（H1N1和H3N2）减毒活流感病毒（LAIV）在美国商业化，作为Ingelvac Provenza™（Boehringer Ingelheim, St. Joseph, MO, USA）用于通过鼻内途径在猪仔一天大时使用。这种疫苗的实验证据显示了在接种后12天感染的猪中减少了IAV脱落。

表 1：针对PRRSV和流感病毒的商业化疫苗概览，包括制造商、类型和给药方法

减毒活疫苗（LAVs）也被用来控制非洲猪瘟（ASF）和经典猪瘟（CSF）。近期的研究进展提升了公众对开发出既有效又安全的疫苗的期待。特别值得一提的是“ASFV-G-ΔMGF”，这款减毒活疫苗在临床前研究中展现出了积极的结果。研究发现，感染非洲猪瘟病毒（ASFV）的猪只若能存活，便能对新的感染产生保护性免疫反应，这为开发有效的ASFV疫苗提供了可能性。尽管如此，包括灭活疫苗、重组蛋白疫苗和DNA疫苗在内的其他疫苗研发尝试，即便结合了特定的佐剂，也未能成功。因此，减毒活疫苗（LAV）成为了开发针对ASFV有效疫苗的关键途径。截至2021年，尚无商业化的ASF疫苗上市。但据报告，越南的国家兽医医药联合储备公司（NAVETCO）开发的NAVET-ASFVAC疫苗已成为首个商业化的ASF疫苗。尽管商业化的ASF活疫苗报道不多，但已有研究显示，基于自然减毒株（NH/P68; OURT/88/3）和强毒株（Georgia07; Benin 97/1; Ba71）的疫苗候选物开发的ASFV LAVs能提供从0到100%不同程度的保护。

在全球多个地区，减毒活疫苗（LAVs）被广泛应用于防控经典猪瘟（CSF）。它们在推动CSF根除方面发挥了重要作用，但因无法区分自然感染与疫苗免疫动物（DIVA），存在显著缺陷。在众多针对CSF的LAVs中，C-Strain因其对所有CSFV基因型均有效而被广泛采用。CSFV的减毒疫苗株主要通过在兔子或细胞培养中连续传代来生产。除了C-strain，还有如法国细胞培养适应的Thiverval、菲律宾 Coronel株（LPC）、低温适应的日本豚鼠exaltation阴性（GPE-）株、墨西哥PAV株和LOM株等也被考虑作为LAV候选物。由于伦理和规模化生产的考量，研究逐渐转向基于细胞培养的LAV生产。然而，高昂的生产成本和资源匮乏地区的管理难题导致病毒在接种群体中持续传播，长期次优疫苗接种可能导致CSFV株的致病性和抗原性变化，进而产生逃逸变异株。C-strain不仅用于家猪免疫，还有报道称其作为野猪和农村家猪的口服疫苗使用。与注射疫苗相比，口服疫苗更有效且易于管理，其结合粘膜免疫反应、增强免疫激活、广泛免疫保护和适合大规模接种的特点使其非常有效。在口服疫苗配方上取得的进步包括将C-strain吸附到面包上后进行冷冻干燥制成诱饵，这种疫苗在4°C下稳定18个月，与需要-20°C储存的商业液体C-strain口服疫苗相比具有优势。监测口服疫苗接种后人群中的抗原-抗体反应对于控制野猪中的CSFV传播至关重要。

3.3. 减毒 活 DIVA疫苗

传统减毒活疫苗和灭活疫苗虽能有效提供保护，但不具备区分感染与免疫动物的DIVA特性。能够轻松且精确地在血清学上区分感染与免疫动物的疫苗被称为标记疫苗。其中，重组嵌合病毒和基因缺失型标记疫苗尤为重要。嵌合病毒技术利用一种病毒的骨架搭载另一种病毒的基因，构建强有力的疫苗平台。在猪瘟病毒的候选疫苗中，以CSFV或BVDV的感染性cDNA克隆表现最为突出。CP_E2alf标记疫苗作为首款活标记疫苗，以“Suvaxyn® CSF Marker”之名获得Zoetis公司的许可，并被欧盟批准用于紧急情况下的疫苗接种，以实现有限的疾病控制。另一种嵌合病毒CP7_E2gif也受到关注，它基于BVDV骨架，但不包含CSFV的基因，而是将BVDV的包膜蛋白E2替换为其在边界病病毒（BDV）中的同源蛋白。PRV HD/c疫苗通过删除特定的gE/TK基因，用于控制伪狂犬病，这种基因缺失型疫苗能够区分自然感染与疫苗接种。

3.4. 病毒载体疫苗

重组病毒与活病毒一样高效，并保留了活疫苗的其他优势，同时具有更好的安全性。病毒载体疫苗的工作原理如图3所示。

图3：病毒载体疫苗的工作原理示意图

SV40病毒载体，作为首个在1972年被创建用于外源基因表达的病毒载体，标志着疫苗学的一个重要里程碑。自此，多种病毒被探索并开发成为抗原传递的载体。在兽医学领域，腺病毒、疱疹病毒、痘病毒和副黏病毒等成为常用的载体，其中腺病毒载体因其遗传安全性高、致病性低、不整合入宿主基因组等优势，成为疫苗传递的理想选择。痘病毒，包括牛痘、金丝雀痘和禽痘等，也被成功用于传递外源抗原。活体哺乳动物病毒载体分为复制型和复制缺陷型，前者能在宿主细胞内高效复制，而后者缺乏必要的复制和组装功能。猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）也被报道作为活病毒疫苗，以多组分病毒载体疫苗的形式表达lAV和PCV2的抗原蛋白，显著降低了PRRSV、PCV2和IAV感染后的肺部和淋巴样病变，减轻了急性呼吸症状。

新城疫疫苗（NDV）通过表达CSFV的E2和Erns蛋白，已被证实为一种经济效益高的疫苗生产替代方案。该疫苗还能通过鼻内给药，直接在病毒的主要侵袭和复制区域提供病毒蛋白。此外，CSFV的E2蛋白也已成功利用重组杆状病毒和猪痘病毒技术进行表达。

4. 亚单位疫苗

随着免疫学领域的不断进步，我们对抗原结构和免疫原性部分的认识变得更加深入。病毒表面蛋白和肽成为开发针对病毒病原体的亚单位疫苗的主要候选物。同时，多糖和结合亚单位疫苗也被证明能有效对抗某些细菌病原体。这些免疫原性蛋白可以通过从病毒中直接分离或利用重组DNA技术来表达。亚单位疫苗相较于其他类型的疫苗具有多项优势，尤其是其安全性。由于不含有活性成分，亚单位疫苗无法恢复成感染性或致病性形式，仅针对特定免疫原部分引发免疫反应。此外，这项技术已经相当成熟，适用于包括免疫功能低下者和孕妇在内的广泛人群，具有极高的安全性。亚单位疫苗在注射部位不会引起副作用，稳定性较好，且便于运输和储存。

亚单位疫苗因其能够激发针对特定免疫决定簇的精准免疫反应而备受青睐。这种疫苗的生产过程更为简化，且不同生产批次间的差异性降至最低。尽管亚单位疫苗拥有众多优势，它们在免疫原性方面相较于减毒疫苗仍显不足，通常需要额外的佐剂和加强剂来增强和延长免疫保护。在当前对疫苗的需求中，能够实现区分感染与免疫动物（DIVA）的疫苗对于控制传染病至关重要，亚单位疫苗因其固有的DIVA特性而在这方面展现出优势。因此，科研人员已经投入大量精力来识别适合开发亚单位疫苗的蛋白候选物。鉴于亚单位疫苗的开发依赖于对预期免疫反应的微生物成分的深入了解，因此对抗原蛋白或肽的预测变得尤为重要，这可以基于康复动物的血清学反应快速进行。现代生物信息学工具的发展，使我们能够更准确地预测抗原决定簇（见表2）。

表 2：不同猪病毒的亚单位疫苗候选抗原蛋白

4.1. 纯化抗原

纯化抗原，作为病原体分解后得到的特定成分，被用于疫苗制备。它们通常分为四大类：基于蛋白的抗原、多糖、黏附素和类毒素。这些抗原主要用于针对细菌性病原体的疫苗开发，而在病毒性病原体中的应用相对较少。在猪病毒性疾病领域，基于纯化病毒抗原的商业化疫苗极为罕见。

4.2. 重组蛋白

随着蛋白表达和纯化技术的进步，病毒抗原蛋白的生产变得更加便捷且成本效益高。病毒抗原蛋白主要通过原核和真核表达系统进行表达。在原核表达系统中，大肠杆菌和枯草杆菌因其快速生长、易于规模放大、高产出和低成本等优势，成为表达病毒抗原的最常用微生物。尽管这些系统缺乏转录后和翻译后修饰能力，以及存在密码子使用偏好的问题，但通过工程改造的菌株可以克服这些限制，实现特定蛋白的精确修饰。例如，猪圆环病毒2型（PCV2）的重组衣壳蛋白已在大肠杆菌中成功异源表达，并被用作亚单位疫苗。非洲猪瘟病毒（ASFV）的高抗原性pK205R蛋白也已在大肠杆菌中成功克隆和表达。此外，包含PRRSV的GP3、GP4、GP5和M基质蛋白的短氨基酸序列的嵌合蛋白在大肠杆菌中表达，并在小鼠和仔猪中激发了强大的免疫反应。

真核表达系统，包括酵母、哺乳动物、昆虫和植物细胞，因其能够提供翻译后修饰、高可扩展性，以及与自然病毒复制周期相似的密码子使用模式而受到青睐。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和毕赤酵母（Pichia pastoris）是生产病毒蛋白的常用酵母，这些系统以快速生长、低成本、高产出和优质的蛋白修饰及折叠能力著称。尽管酵母系统在很多方面优于原核表达系统，但在猪疫苗领域的应用并不广泛。有研究报道，全酵母疫苗在口服给药时能有效诱导猪产生针对PEDV-S1蛋白的高IgA反应。

哺乳动物表达系统在生产复杂分子和实现精确糖基化方面最为适宜。然而，这一系统也存在一些局限性，如可扩展性较低、生产成本高、内源病毒污染风险和增殖速度慢。人类胚胎肾细胞（HEK-293）和中国仓鼠卵巢细胞（CHO）是两种广泛用于病毒蛋白表达的哺乳动物细胞系。尽管如此，哺乳动物细胞在猪疫苗开发中的应用仍然有限。研究表明，使用酵母、昆虫和哺乳动物细胞这三种真核表达系统表达PEDV S1蛋白时，HEK-293细胞中糖基化蛋白的产量最高，且接种后的母猪和仔猪能产生高滴度的中和性IgG和IgA。CSFV的主要免疫原性蛋白E2也在HEK-293和CHO细胞中成功表达。

杆状病毒，一类感染超过600种昆虫的DNA病毒，对哺乳动物无害，是理想的哺乳动物和病毒蛋白表达载体。其中，Autographa californica核型多角体病毒（AcMNPV），携带134 kb的环状双链DNA基因组，是作为昆虫细胞蛋白表达载体中最为特征化的杆状病毒。由于杆状病毒载体不会在宿主细胞内复制或整合到宿主染色体中，因此具有较高的安全性。基于杆状病毒的表达系统广泛应用于多种猪病毒亚单位疫苗的生产，包括实验性和商业化疫苗，如PCV2、猪细小病毒（PPV）和CSFV疫苗（见表3）。此外，杆状病毒载体也成功用于伪狂犬病病毒（PRV）糖蛋白D、CSFV和乙型肝炎病毒免疫蛋白的实验性表达。

表 3：基于杆状病毒表达系统的商业化猪亚单位病毒疫苗

植物源疫苗技术：植物作为一种平台，已被广泛用于重组蛋白和治疗剂的大规模生产。美国农业部批准的首个植物源新城疫病毒兽医疫苗，标志着该领域的一项重大进展。这一批准不仅开启了植物大规模生产兽医疫苗的新篇章，而且由于其低成本生产优势，植物成为了具有吸引力的生物制造工厂，具备易于操作、高安全性、良好的可扩展性以及能够进行翻译后修饰等多重优势。

在植物中生产的CSFV-E2蛋白已在拟南芥和本氏烟中获得成功，并展现出良好的免疫原性。特别地，在本氏烟中生产的E2二聚体，被证实在单剂量配合佐剂使用时，能够为CSFV提供充分的保护。此外，基于转质体烟草植物的PEDV亚单位疫苗候选物也已在猪身上进行了应用。通过农杆菌介导的转化技术，香蕉植物胚胎细胞中成功表达了PRRSV的ORF-5基因，并显示出积极的实验结果。同时，也有研究报道了在烟草和马铃薯植物中表达PRRSV的情况。

转基因动物技术：作为一种新兴的疫苗生产平台，动物生物反应器在制造兽医亚单位疫苗方面展现出巨大潜力。借助尖端分子生物学技术，疫苗成分能够在动物的乳汁和鸡蛋中得到表达和分泌。尽管目前关于利用转基因动物生产猪病毒亚单位疫苗的研究尚不多见，但已有研究表明，在腺病毒转导的山羊乳腺中生产的E2-CSFV疫苗候选物，能够有效地为猪提供长期保护。

4.3. 合成肽疫苗

随着对抗原和表位结构认识的深入以及多肽合成技术的进步，开发肽模拟物成为现实。合成肽疫苗拥有其他疫苗平台所不具备的独特优势，它们能够模拟病原体中的B细胞和T细胞表位。尽管针对猪病毒病的合成肽疫苗研究较少，尤其是与口蹄疫病毒（FMDV）相关的疫苗，这主要是因为线性肽的免疫原性较弱，只能提供部分保护。然而，多聚化技术的发展为合成肽疫苗带来了新机遇，其中树状大分子技术尤为突出。这些多聚肽结构相较于线性肽，能够激发更强烈的免疫反应和提供更全面的保护。已有研究表明，含有多个针对FMDV或CSFV的B细胞和T细胞表位的肽树状大分子，在免疫效果上取得了成功。

5. 核酸疫苗

核酸疫苗，也称作基因疫苗，包含DNA或RNA核酸，这些核酸直接注射后被细胞吸收，用以产生蛋白质，进而引发体液和细胞介导的免疫反应。

5.1. DNA疫苗

DNA疫苗利用携带病原体抗原蛋白编码基因的质粒。这些裸露的质粒注射到接种者肌肉中，由肌肉细胞吸收并表达抗原蛋白。在这个过程中，树突状细胞（DCs）扮演了关键角色；它们将抗原呈递给主要组织相容性复合体（MHC）的I类和II类分子，这些分子再将抗原呈递给免疫细胞，触发细胞因子的产生和对CpG寡脱氧核苷酸的反应。因此，DCs作为天然的佐剂，尤其在基因免疫中，使得DNA疫苗成为一种有前景的策略。DNA疫苗已被开发并针对多种猪病毒病进行实验评估。例如，针对流感病毒的表位驱动的质粒DNA（pDNA）疫苗在皮内给药时，与传统肌肉内给药的商业灭活全病毒疫苗相比，能激发更强的细胞介导免疫（CMI）反应。编码ASFV免疫原蛋白p30和p54基因的DNA疫苗在小鼠中能诱导出显著的抗体滴度，但在猪中效果有限。然而，通过在疫苗中加入ASFV血凝素（sHA）的细胞外域，能显著提高免疫效果。针对CSFV E2蛋白基因的DNA疫苗在对抗CSFV时显示出完全保护效果。最近，一种新型双价疫苗，包含编码CSFV E2和Erns蛋白的重组α病毒质粒以及PCV2的Cap，在小鼠中显示出希望。利用DNA疫苗策略，针对不同毒株的病毒开发了镶嵌疫苗，例如含有PRRSV镶嵌序列的DNA疫苗，与阳离子脂质体共给药时，能诱导对异源感染的有效细胞免疫反应。

5.2. mRNA疫苗

mRNA疫苗接种技术是一种前沿、安全、迅速且高效的疫苗策略，已被证实具有安全性和有效性。该技术利用宿主细胞的翻译机制在体内合成抗原蛋白，模拟自然感染过程。初步研究显示，当以两次80微克的剂量、间隔21天接种狂犬病mRNA疫苗时，在小鼠和猪模型中观察到高水平的中和抗体滴度以及抗原特异性的细胞毒性T细胞和辅助T细胞反应。针对PRRSV设计的基于单一GP5 mRNA或融合GP2-GP5-M-mRNA的mRNA疫苗，均显著增强了细胞和体液免疫反应。尤其在大剂量接种时，GP5-mRNA疫苗展现出与商业疫苗相媲美的免疫效果。然而，目前的实验仅限于小鼠模型，尚未涵盖对猪的免疫效果和保护力研究。此外，针对PEDV的mRNA疫苗候选物已在小鼠和怀孕母猪中进行了测试，结果显示它们能引发强烈的体液和细胞免疫反应，以及高水平的中和抗体。特别是在怀孕母猪中，基于受体结合区域（RBD）异二聚体的mRNA PED疫苗接种后，中和抗体水平与现有灭活疫苗相当。另一种针对PEDV S蛋白的mRNA疫苗在免疫仔猪中诱导了强烈的抗体反应和抗原特异性T细胞反应。此外，利用脂质纳米颗粒技术开发的表达可溶性G糖蛋白的mRNA载体尼帕病毒（NiV）疫苗在猪中进行了开发。加强免疫后，猪血清显示出高抗原结合和病毒中和抗体，这些抗体还能阻止糖蛋白介导的细胞-细胞融合。加强免疫后，可以检测到特定的T细胞细胞因子反应，表明CD4和CD8 T细胞均被诱导。

6. 新一代疫苗技术

传统疫苗如灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗已应用数十年，各有其优势与局限。当前，科研人员正采用创新方法来增强疫苗的长期效应，旨在提升动物的免疫力和长期保护能力。新一代疫苗技术包括病毒样颗粒（VLPs）、基于树突状细胞的疫苗和粘膜疫苗等。

6.1. 病毒体和病毒样颗粒（VLPs）

病毒体由单层或双层含病毒糖蛋白的磷脂膜构成，能与目标细胞融合，因此可作为药物或疫苗的传递工具。VLPs则是由多个亚单位组成的蛋白质结构，模拟天然病毒颗粒。由于其纳米尺寸，VLPs易于被抗原呈递细胞识别，进而激活T细胞。这一特性已被应用于开发针对TGEV和PRRSV的疫苗。为激发可检测的干扰素（IFN）反应，已成功构建表达TGEV重组M和E蛋白的假病毒颗粒。对于PRRSV，病毒体作为一种有前景的疫苗载体，也被报道能靶向浆细胞样树突状细胞（pDCs）以激发T细胞反应。虽然病毒体在猪疫苗中的应用尚不广泛，但VLPs已在多次研究中显示出成功。例如，表达M和N蛋白的PED VLPs能引发广泛的细胞免疫反应。PCV2的ELPylated cap蛋白通过增加细胞因子和抗体的产生，增强了免疫效果。PRV和PRRSV的VLPs已通过重组病毒方法在宿主细胞中形成，其中rPRV-NC56是一种携带PRV变体株XJ和NADC30样PRRSV株CHSCDJY-2019基因的伪狂犬病病毒，能持续表达GP5和M蛋白。2A自切割肽的引入使得GP5和M蛋白能够独立表达，形成PRRSV VLPs，并激发细胞和体液免疫反应。VLPs技术在针对多种病原体的应用中取得了进一步进展，为PCV 2和FMDV等病毒提供了有前景的新方法]。

6.2. 粘膜疫苗

粘膜疫苗通过鼻、口以及眼部途径进行给药。这类疫苗主要针对PRRSV、CSFV、FMDV、PEDV和PCV2等病毒。由于粘膜疫苗能够激发分泌性抗体反应，它们在预防那些主要通过粘膜途径感染的病毒方面显示出巨大潜力。结合合适的佐剂（如M. tuberculosis WCL、霍乱毒素B亚单位和OK-432），粘膜疫苗已成功用于控制流感病毒、PRRSV、脊髓灰质炎病毒、轮状病毒、副流感-3病毒和呼吸道合胞病毒等多种病毒。此外，减毒活疫苗和灭活疫苗也能通过口服或鼻内途径用于PEDC或TGEV的免疫。

6.3. 树突状细胞疫苗

亚单位疫苗携带特定病毒抗原，并可与树突状细胞（DCs）靶向肽融合，以此增强动物的T细胞介导免疫反应。除了肽，疫苗佐剂如α-D-葡聚糖和poly (I:C)也能激活DCs，与病毒抗原联合使用，增强动物的免疫应答，如猪流感病毒的案例所示。PEDV疫苗以减毒活病毒、灭活病毒或基于蛋白的重组粘膜疫苗形式存在，这些疫苗能显著刺激DCs，促进细胞因子的产生。对于ASFV，尽管其绕过抗原呈递细胞（APCs）并积极复制，但使用更好的佐剂或肽以及传统疫苗开发基于DC的疫苗仍具有潜力。此外，PRRSV中的猪DC-SIGN在树突状细胞内引发猪抗原特异性CD4 T细胞免疫反应，并增加白介素的产生。

6.4. 多价和多联疫苗

多价疫苗能够同时针对两种或更多种病毒，这与传统疫苗通常只针对单一病毒不同。常见的多价疫苗组合包括PCV2与其他病毒和非病毒性病原体。由PCV2的Cap蛋白衍生的病毒样颗粒（VLPs）对其感染具有显著效果，并且可以通过整合来自IAV、FMDV或PRRSV等其他病毒的免疫调节肽或蛋白，利用spycatcher/spytag技术，来增强对PCV2及其他病原体的防御。在某些情况下，疫苗的双价特性也适用于同一病毒的多个蛋白，例如流感病毒的血凝素和神经氨酸酶，以增强疫苗效力。另一个例子是包含猪轮状病毒VP7蛋白的rPEDV-PoRV-VP7重组病毒疫苗。此外，含有同一病毒多肽（I:C）的多价疫苗在FMDV中也显示出提供交叉保护的效果。

7. 反向遗传学和个性化疫苗

反向遗传学（RG）技术是一种从基因组信息到蛋白质功能的转化方法，它利用包含抗原蛋白信息的基因组序列来开发疫苗。PRRSV和猪流感病毒的反向遗传学研究已经成功地产生了改良的病毒抗原。PRRSV的反向遗传学系统为创新PRRSV疫苗的合理开发提供了基础，通过随机序列重新排列来创造PRRSV的免疫学变体。RG技术是生产基因修饰的RNA和DNA病毒的重要手段，尤其在流感病毒研究中，它有助于深入理解病毒的增殖、致病性、传播和疫苗开发。RG技术也被应用于PEDV等虫媒病毒，为开发更有效的疫苗提供了可能。个性化疫苗学基于评估个体的遗传背景、性别和其他可能影响疫苗抗原性、效力和安全性的因素。这种方法建议根据个体差异开发特定疫苗，以克服免疫原性差和减少不良事件的风险，流感疫苗就是一个很好的例子。尽管个性化疫苗学尚未在动物疫苗开发中得到应用，但这一领域具有巨大潜力，并有望扩展到猪疫苗，以及更广泛的病毒病原体疫苗开发中。

8. 疫苗给药途径

综述:猪病疫苗现状及展望

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