摘 要：目的 通过多种化学成分的含量变化，评价晒干、阴干、红外干燥（50、60、70、80 ℃）、微波干燥（50、60、70、80、100 ℃）和热风干燥（50、60、70、80 ℃）等15种干燥方法对益母草药材品质的影响，并优选出适宜的益母草产地加工方法。方法 运用UPLC-QTRAP®/MS2法测定益母草中3个生物碱类成分（盐酸水苏碱、盐酸益母草碱、葫芦巴碱）、4个酚酸类成分（苯甲酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸）、5个苯丙素类成分（红景天苷、毛蕊花糖苷、绿原酸、咖啡酸、阿魏酸）、11个黄酮类成分（芦丁、异槲皮苷、金丝桃苷、汉黄芩素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、芫花素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素、橙皮素、槲皮素）和1个环烯醚萜苷类成分（益母草苷）的含量变化。结合主成分分析（PCA）和逼近理想值排序法（TOPSIS），综合评价不同干燥方式得到的益母草样品的品质。结果 不同干燥方式对益母草中24个化学成分的含量影响显著，基于此进行PCA并将15种干燥方法分为3类；另外采用TOPSIS法对15种干燥方法进行评分，前3位为热风70 ℃、热风60 ℃和微波100 ℃干燥，都在很大程度上保留了益母草中活性成分。结论 结合实践，优选热风70 ℃干燥为益母草产地加工工艺，为益母草的品质提供保障，为全国益母草生产加工提供科学依据。
益母草，又名益母艾、苦草、坤草等，为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt. 的新鲜或干燥地上部分，一年或二年生草本，夏季开花。其味辛，微苦，性微寒，归肝、心包经，《神农本草经》列为上品，历代本草均有收载。益母草属植物全球分布23种5变种，主要分布在欧洲及亚洲温带，少数种别在美洲、非洲各地。我国有12种和2变种，全国各地都有分布，益母草多生于原野荒地、路旁、草地、堤旁、溪边、多石的山坡，以阳处为多，亦有栽培。益母草为传统中药，其药用历史悠久，具有活血调经、利尿消肿、清热解毒之功效，用于月经不调、恶露不尽，素有“血家圣药”之称[1-2]。现代研究表明益母草中富含生物碱类化学成分[3-4]，以及黄酮类、酚酸类、萜类成分[5-8]，多具有显著的生物活性，包括活血、抗菌、抗炎[9-11]，为其传统功效发挥的主要物质基础。
益母草药材的产地传统加工方法为夏季茎叶茂盛、花未开或初开时，采割后晒干。传统干燥方法具有周期长、受天气影响大、干燥后药材质量不均一等弊端。近年来，应用于现代中药材的干燥技术逐渐被开发出来，主要有热风干燥、微波干燥、红外干燥等[12-13]。热风干燥主要以流动热风加热药材并带走水分，具有成本低、效率高等优点，不受天气影响，适用于大多数中药材的干燥加工[14]；微波干燥具有脱水快、杀酶保苷的优点，常用于富含苷类成分的中药材的干燥[15]；红外干燥的脱水效率则介于热风干燥和微波干燥之间，主要用于易霉变及贵重中药材的干燥加工[16]。
本研究以益母草药材为研究对象，比较了传统晒干、阴干以及现代多种干燥方法（热风干燥、微波干燥和红外干燥）对益母草药材品质的影响，通过对多种化学成分的变化分析[17]，为益母草产地加工工艺优选提供科学基础，也为益母草的质量保证及临床有效应用提供重要支撑。
1 仪器与材料
1.1 仪器
电热鼓风干燥机，上海精宏实验设备有限公司；中短波红外干燥机，江苏泰州圣泰科红外科技有限公司；隧道式微波干燥机，南京研正微波设备厂；Triple Quad 6500系统（包括四元泵溶剂系统，在线脱气机和自动进样器）、MultiQuant质谱工作站，AB SCIEX公司；PMB53型艾德姆水分测定仪，德国Adam公司；电子分析天平，瑞士Mettler Toledo公司；Millipore超纯水系统，苏州赛恩斯仪器有限公司；KH5200B型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；Anke GL-16GII型离心机，上海安亭科学仪器厂。
1.2 材料
益母草新鲜药材（批号20180809）采于江苏省淮安市盱眙中药材种植基地，经南京中医药大学严辉副教授鉴定为唇形科植物益母草Leonurus japonicus Houtt. 地上部分，凭证标本存放于南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心（编号320830150716023LY）。对照品盐酸益母草碱（批号24697-74-3）、盐酸水苏碱（批号4136-37-2）、汉黄芩素（批号625-85-9）购自成都克洛玛生物科技有限公司；山柰酚-3-O-芸香糖苷（批号S-065）购自成都瑞芬思生物科技有限公司；毛蕊花糖苷（批号SA8050）由北京索莱宝科技有限公司提供；葫芦巴碱（批号JBZ-0520）、益母草苷（批号JBZ- 1603）、红景天苷（批号JBZ-0503）、绿原酸（批号JBZ-0666）、对羟基苯甲酸（批号JBZ-0291）、咖啡酸（批号JBZ-0629）、香草酸（批号JBZ-1333）、丁香酸（批号JBZ-0247）、芦丁（批号JBZ-0660）、异槲皮苷（批号JBZ-1459）、金丝桃苷（批号JBZ- 0554）、阿魏酸（批号JBZ-0002）、苯甲酸（批号JBZ-0036）、芫花素（批号JBZ-1474）、芹菜素（批号JBZ-0905）、山柰酚（批号JBZ-1079）、异鼠李素（批号JBZ-1422）、橙皮素（批号JBZ- 0155）、槲皮素（批号JBZ-0472）由南京金益柏生物技术有限公司提供。以上对照品质量分数大于98%。甲醇、乙腈、甲酸，色谱纯，德国Merck公司；超纯水，实验室自制，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 干燥加工方法
取益母草新鲜药材，去除杂质，切成10～15 cm的带叶茎枝，混合均匀，分别取样约1 kg，干燥加工方法分别为红外50 ℃干燥360 min（S1）、红外60 ℃干燥320 min（S2）、红外70 ℃干燥270 min（S3）、红外80 ℃干燥120 min（S4）、微波50 ℃干燥180 min（S5）、微波60 ℃干燥120 min（S6）、微波70 ℃干燥80 min（S7）、微波80 ℃干燥60 min（S8）、微波100℃干燥35 min（S9）、热风50℃干燥420 min（S10）、热风60℃干燥300 min（S11）、热风70℃干燥240 min（S12）、热风80℃干燥200 min（S13）、晒干2880 min（S14）、阴干7200 min（S15）。干燥前取约1 kg鲜样测定其初始水分，干燥过程中观察并记录实时含水率，含水率达10%时停止干燥。
2.2 色谱和质谱条件
2.2.1 色谱条件 Acquity UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱温为35 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈；梯度洗脱程序为0～2.0 min，10%～30%乙腈；2.0～5.0 min，30%～50%乙腈；5.0～7.0 min，50%～80%乙腈；7.0～8.5 min，80%～10%乙腈；8.5～10.0 min，10%乙腈；体积流量0.4 mL/min；进样体积为2 μL。
2.2.2 质谱条件 离子源为ESI源；多反应监测（MRM）方式；离子源温度150 ℃；毛细管电压5.0 kV；脱溶剂气温度550 ℃；脱溶剂气流量1 000 L/h。优化后的色谱图见图1，各对照品色谱、质谱参数见表1。
2.3 对照品溶液的制备及线性关系考察
取盐酸益母草碱、盐酸水苏碱、汉黄芩素、山柰酚-3-O-芸香糖苷、毛蕊花糖苷、葫芦巴碱、益母草苷、红景天苷、绿原酸、对羟基苯甲酸、咖啡酸、香草酸、丁香酸、金丝桃苷、阿魏酸、苯甲酸、芫花素、芹菜素、山柰酚、异鼠李素、橙皮素、槲皮素、芦丁和异槲皮苷对照品适量，精密称定，以甲醇溶解，配成质量浓度分别为0.64、1.00、1.06、1.19、1.23、1.16、1.58、1.11、1.03、1.19、1.36、1.37、1.11、1.17、1.11、1.32、0.26、0.34、1.30、0.21、1.25、1.03、1.29、1.42 mg/mL的混合对照溶液。
精密吸取上述混合对照品溶液适量，稀释成系列不同质量浓度的混合对照品溶液，以各对照品峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），考察线性关系。连续进样样品空白溶液11次，测定24种化学成分的信号响应值，以其信号响应值的标准偏差（δ）的3倍所对应的质量浓度为检测限（LOD），10倍所对应的质量浓度为定量限（LOQ），结果见表2。
2.4 供试品溶液的制备
取样品粉末（打粉，过三号筛）1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇30 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率500 W）40 min，放冷，用70%乙醇补足减失的质量，取上清液，离心（13 000 r/min）10 min，经0.22 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。
2.5 精密度试验
取“2.3”项下混合对照品溶液，按照“2.2”项下色谱和质谱条件在第1天和第2天分别连续进样6针，结果见表3。结果显示，24个待测成分峰面积的日内和日间精密度的RSD均小于4.59%，表明仪器精密度良好。
2.6 重复性试验
取S15号样品粉末约1.0 g，平行称定6份，分别按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按照“2.2”项下色谱和质谱条件进样测定，结果见表3，各待测成分质量分数的RSD均小于4.61%，表明该方法的重复性良好。
2.7 稳定性试验
取“2.5”项下供试品溶液（S15）1份，分别于0、2、4、8、12、24 h进样测定，结果见表3，各待测成分峰面积的RSD均小于4.78%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.8 加样回收率试验
取已知含量的S15号样品粉末约1.0 g，平行称定9份，根据样品中成分质量分数的50%、100%、150%分别加入相应对照品，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱、质谱条件进样测定，计算各成分的加样回收率及RSD值，结果见表3。各待测成分的平均回收率均在100%左右，且RSD均小于4.42%，表明该方法准确度良好。
2.9 样品测定与结果
取不同干燥条件下的益母草粉末，按照“2.4”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱和质谱条件分别进样测定。数据使用MultiQuant软件定量分析，计算24种待测成分的质量分数，结果见 表4。
2.9.1 生物碱类成分含量变化 不同的干燥方法对盐酸益母草碱的含量无明显影响，但是葫芦巴碱和盐酸水苏碱的含量变化有显著的差异。其中热风60 ℃（S11）和热风70 ℃（S12）2种干燥方法尤其突出，这2种成分的含量是其他干燥方法的9～15倍；同时现代加工方法（热风、微波和红外干燥）明显优于传统加工方式（晒干和阴干，S14、S15），前者生物碱类成分的含量普遍高于后者，且晒干优于阴干。
研究表明，生物碱类成分是一类重要的含氮杂环化合物，氨基酸和含氮羧酸提供了氮原子和主体骨架结构[18-20]。常见的合成前体有色氨酸、苯丙氨酸、烟酸等，它们可以通过非核糖体肽合成酶（NRPS）活化加载参与生物碱的合成。一般生物碱类成分热稳定性较好，但是在氧化作用下易转化为其他成分。由此推测，现代加工方法时间短，益母草中生物碱类成分保留多，而传统加工方法时间长，药材在空气中暴露时间久，生物碱类成分则流失多。
2.9.2 酚酸类成分含量变化 不同干燥方式获得的益母草中的苯甲酸和对羟基苯甲酸的含量差异趋势是一致的，而香草酸和丁香酸则是一致的。整体而言，热风60 ℃（S11）和热风70 ℃（S12）2种干燥方法依然最大程度地保留了益母草中酚酸类成分。但是，对于苯甲酸和对羟基苯甲酸的含量，阴干（S15）＞晒干（S14），甚至超过了热风50 ℃（S10）和微波60 ℃（S6）干燥；对于香草酸和丁香酸而言，则晒干＞阴干，同样超过了部分现代加工方法，比如红外80 ℃（S4）和微波100 ℃（S9）干燥。说明传统加工方法存在合理性与科学性。
研究表明，酚类物质（包括酚酸类、黄酮类）在植物体内的生物合成和代谢受苯丙氨酸解氨酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）的调控，温度过高则会破坏植物中的酚酸类成分[21-23]。本研究结果显示，不同干燥方法加工的益母草中酚酸类成分含量差异大，变化范围宽，推测可能是干燥过程中PAL和PPO的酶活性发生变化，导致成分差异明显。其中，热风60 ℃（S11）和70 ℃（S12）干燥为最佳方式，推测60～70 ℃可能是酶活性最佳温度。
2.9.3 苯丙素类成分含量变化 首先，热风70 ℃（S12）干燥得到的益母草中的苯丙素类成分的含量依然高于其他干燥方式；其次，微波100℃（S9）干燥处理的益母草样品中毛蕊花糖苷的含量最高，红景天苷和绿原酸的含量也排前列，远高于红外、微波干燥和晒干、阴干等其他干燥方法；然后，阴干（S15）的益母草中阿魏酸和咖啡酸的含量优于红外干燥（50、60、70、80 ℃）。
研究表明，具有邻二酚羟基结构的成分易被植物中的相关酶催化氧化，而且在热和氧的作用下，自身可氧化降解，甚至结构变形，导致成分在干燥过程中不断降解，如实验所测的咖啡酸[24-25]。实验结果说明阴干温度低，有利于益母草中阿魏酸和咖啡酸成分的保留；另一方面，100 ℃微波（S9）干燥则更利于毛蕊花糖苷和红景天苷的保留，推测是100 ℃杀青起到了“杀酶保苷”的作用[26]。
2.9.4 黄酮类成分含量变化 整体而言，热风70 ℃（S12）干燥最大程度地保留了益母草中黄酮类成分的含量，且热风干燥＞微波干燥＞阴干＞晒干＞红外干燥。其中微波100 ℃（S9）干燥则最大程度地保留了芦丁和槲皮素2个成分，红外干燥对芹菜素保留效果佳，而其他干燥方式则无明显差异。
研究表明，植物中黄酮类化合物来源于苯丙烷类代谢途径，受多个酶的控制如苯丙氨酸解氨酶、查耳酮合成酶，而高温可以使酶失活以减少黄酮类成分的降解[27]。实验结果显示热风70 ℃（S12）干燥为最佳工艺，推测其可能是高温让益母草中的酶失活，所以黄酮类成分有了较好的保留。
另一方面，部分黄酮类成分如槲皮素、芫花素、汉黄芩素等只在部分加工后的益母草中检测到，推测可能是益母草中所含的这几种成分含量偏低，低于仪器检测限度，所以未能检出[28]。
2.9.5 环烯醚萜苷类成分含量变化 环烯醚萜苷类成分在益母草中含量偏低，仅热风60、70 ℃（S11、S12）干燥和微波50、60 ℃（S5、S6）干燥加工后的样品中有保留，其他干燥方式都未检测到。也体现出现代加工方法相较于传统方法的优势。
2.10 适宜干燥方法的综合评价
为了优选出益母草药材的适宜的产地干燥加工方法，对不同方式干燥的益母草药材样品进行综合评价。以益母草中所测的24种化学成分为指标，对15种干燥加工方式进行主成分分析（PCA）和逼近理想值排序法（TOPSIS）分析，优选出最适宜的益母草干燥方法。
2.10.1 PCA 采用SPSS 22.0统计软件，对15批益母草干燥样品进行PCA，结果见表5，前3个主成分PC1、PC2和PC3（特征值大于1）占总贡献率的97.09%，可以客观反映益母草药材的干燥工艺情况，因此选取前3个主成分进行分析[29]。PC1、PC2和PC3的方差贡献率分别为82.66%、7.83%、6.60%，以PC1、PC2和PC3为坐标，得到15批益母草干燥样品的三维散点图（图2）。结果显示，微波100 ℃（S9）、热风60 ℃（S11）和热风70 ℃（S12）分别单独为区域1、3和4，其余样品则聚为区域2。说明热风60 ℃和热风70 ℃在含量上与其余批次差异大，优于其他批次益母草样品；而微波100 ℃的益母草样品则可能是由于总苷成分突出而单独聚类，契合了“杀酶保苷”的概念。
同时将益母草样品的3个主成分进行分析得到各因子总得分，因子总得分则是根据各因子的权重系数进行累加，而权重系数的计算则是基于各主成分的方差贡献率占总累计方差贡献率的百分比[30]。所以，第1主成分PC1的权重系数W1＝82.66%/ 97.09%＝0.85，同理可得主成分PC2和PC3的权重系数分别为0.08和0.07。将各主成分因子得分（Y）与其权重系数乘积相加[31]，得到15批益母草干燥样品的各自总因子得分（F），即F＝Y1W1＋Y2W2＋Y3W3，F值越大则代表该样品的质量越好，结果见表6。结果显示，热风60 ℃和热风70 ℃样品的F值远高于其他批次益母草样品，说明它们益母草样品的优越性，指标性成分的含量最高，同时这也与三维散点图结果一致，说明了热风60 ℃和热风70 ℃是适宜益母草的干燥工艺。
2.10.2 样品TOPSIS分析 采用DPS数据处理系统，以15批次益母草样品中的24个指标性成分含量组成15×24矩阵，对样品测定结果进行TOPSIS分析[32]，结果见表7。TOPSIS评价结果显示，热风70 ℃干燥排名第1，明显优于其他干燥方法。第2～5依次为热风60 ℃、微波100 ℃、晒干和红外60 ℃，说明传统晒干工艺具有其合理性，但是现代干燥工艺则更占优势。热风70 ℃干燥能够最大程度地保留益母草中生物碱类、酚酸类、苯丙素类、黄酮类和环烯醚萜苷类等活性成分，保证益母草的药效，且能在很大程度上节省时间，降低工艺成本。因此，热风70 ℃干燥为益母草药材适宜的现代干燥加工方法。
3 讨论
中药材产地加工是药材流通前质量保证的重要步骤，是把握药材质量的关键环节。不同的干燥加工方式对中药材的质量有很大影响，以前在干姜、当归、忍冬藤等[33-35]中药材上都成功开展了研究。本研究以不同干燥加工方式的益母草样品为对象，研究其在不同干燥方式加工后的化学成分的变化规律，筛选出益母草药材的优势干燥方法，为益母草药材的产地加工提供科学依据。众所周知，中药材的药效组分有其复杂性和多样性，发挥临床疗效的往往不是单个成分或者少数成分，单一指标无法对益母草药材进行全面的品质评价[36]。基于此，本研究建立了一种基于高分辨质谱的快速、简便、稳定、灵敏度高且准确度高的多成分定量方法，采用UPLC-MS/MS，在全扫描模式下对益母草药材进行多成分同时测定并定量。主要考察了传统加工方法和现代加工方法对益母草药材质量的影响，分别是晒干、阴干和红外干燥（50、60、70、80 ℃）、微波干燥（50、60、70、80、100 ℃）和热风干燥（50、60、70、80 ℃）。
PCA和TOPSIS分析结果显示，不同的干燥加工方法对益母草药材中化学成分影响显著。其中，热风70 ℃干燥最大程度地保留了益母草中生物碱类、酚酸类、苯丙素类、黄酮类和环烯醚萜苷类等成分，具有显著的优势。PCA也表现出热风70 ℃的优越性，同时热风60 ℃也很大程度上保留了24种指标性成分。另外，微波100 ℃杀青处理的益母草样品在苷类成分的保留上占优，与其“杀酶保苷”的作用一致。相较之下，其他干燥方法则相差不多，无明显差异。TOPSIS分析同样证明热风70 ℃和热风60 ℃干燥方法的综合评分排在第1位和第2位，相比于其他干燥方法具有明显优势。
《中国药典》2015年版中，益母草的采收加工仅为晒干或切段晒干即可。本研究以益母草中生物碱类、酚酸类、黄酮类和苷类等化学成分为评价指标，通过PCA和TOPSIS分析，比较了传统和现代加工方法对益母草药材品质的影响，研究结果优选出热风70 ℃为益母草的最适宜干燥加工方法，为全国益母草产地加工提供了理论和科学依据，为益母草药材的质量保证提供了重要的前提保障。
参考文献（略）
来 源：谭亚杰，濮宗进，唐于平，严 辉，郭 盛，朱振华，乐世俊，陈艳琰，彭国平，黄胜良，周桂生，段金廒. 基于UPLC-QTRAP®/MS2方法评价不同干燥方式对益母草中化学成分的影响 [J]. 中草药, 2019, 50(7):1576-1586.
