糖尿病（
DM）创伤是糖尿病最严重的并发症之一，不仅严重影响患者的生活，也给社会带来沉重的经济负担。
局部高糖（
HG）环境导致的血管功能障碍是糖尿病伤口愈合延迟的主要致病因素，但具体的病理和分子机制
尚不清楚。
铁死亡是近年来发现的一种调节性细胞死亡形式，在糖尿病伤口进展中起着至关重要的作用
。当成纤维细胞和血管内皮细胞处于高葡萄糖浓度时，它们会产生更多的活性氧
（
ROS）、脂质过氧化产物和铁死亡相关蛋白，导致细胞死亡。因此，如何有效调控高糖下铁死亡是治疗糖尿病创伤的关键。
瞬时受体电位锚蛋白
1 （TRPA1） 是一种非选择性钙通道，可作为多种物理或化学刺激的受体。肉桂醛 （CA） 是一种特定的 TRPA1 激动剂。本研究发现，CA 成功抑制了内皮细胞铁死亡，改善了迁移、增殖和血管形成。进一步的机制研究表明，CA 激活的 TRPA1 诱导的 Ca
2+
内流促进钙调蛋白依赖性蛋白激酶
II（CaMKII）的磷酸化和核因子 E2 相关因子 2 （Nrf2） 易位，从而导致谷胱甘肽过氧化物酶 4（GPX4）升高，进一步抑制内皮细胞铁死亡。将 CA 掺入 MMP-9 响应性可注射双层混合水凝胶（CA@HA-Gel）中，使其以炎症响应的方式有效缓释到糖尿病伤口中，可显著促进糖尿病伤口愈合。
首先，
为了研究糖尿病伤口愈合过程的潜在机制，
研究者
建立了糖尿病小鼠模型
并
在小鼠背部制造一个直径
1 厘米的
皮肤
全层伤口。
结果发现，糖尿病（
DM）组的伤口愈合速度明显慢于对照组（图1B、C），并且DM 组的瘢痕宽度显著大于对照组（图1E、H）。同时，研究者对伤口组织中的 GPX4、MMP-9 和 CD31 蛋白进行了免疫组织化学（IHC）分析。定量分析显示，DM 小鼠中 MMP-9 表达明显增加，GPX4 和 CD31 表达降低（图1F、KM）。这些发现表明糖尿病微环境在体内诱发内皮细胞的局部炎症和铁死亡。
为了进一步
探索
HG诱导内皮细胞铁死亡的分子机制，
研究者
进行了
RNA测序
鉴定
对照组和
HG组
的差异表达
基因。
结果显示，铁死亡途径相关基因表达显著升高，而
TRP基因表达显著下降（图2B）。研究者进一步通过qRT-PCR实验验证了与TRP通道相关的基因，其中TRPA1的表达下调最为显著（图2E）。实验结果表明高糖诱导的铁死亡下调了内皮细胞中TRPA1的表达。根据已发表的文献，激活 TRPA1 可逆转高糖诱导的内皮功能障碍，因此，本研究假设激活TRPA1可缓解高糖诱导的内皮细胞死亡。
肉桂醛
（
CA） 是一种特异性 TRPA1 激动剂，
研究者在随后的
研究
中探究
了
其
在
HG 诱导
的内皮细胞
铁死亡中的潜在作用。
Liproxstatin-1（Lip-1）是一种铁死亡抑制剂，可减轻脂质过氧化物的积累。研究者利用 C11-BODIPY 脂质过氧化探针来表征 TRPA1 在细胞铁死亡中的作用。C11-BODIPY 结果表明，暴露于 HG 环境的内皮细胞表现出显著的脂质过氧化（荧光从红色变为绿色），而 CA 和 Lip-1 处理可有效中和这种影响（图3A 、J）。谷胱甘肽 （GSH） 和丙二醛 （MDA） 是脂质过氧化的重要指标。在 HG 刺激下，GSH 活性显著降低，同时 MDA 生成显著增加，而这种变化可以通过 CA 和 Lip-1 逆转（图3C、D）。
CA和Lip-1干预可以减轻HG引起的线粒体形态变化（图3B）。JC-1是用来测
量线粒体膜电位的探针，当线粒体膜电位较高时，
JC-1在线粒体基质中形成聚集体。然而，当线粒体膜电位较低时，JC-1保持其单体形式，不会在线粒体基质中聚集。流式细胞术（FCM）结果显示，与HG处理组相比，CA和Lip-1组的JC-1单体明显较低（图3E
、
F）。
进一步
Western blotting分析发现，在CA和Lip-1存在下，TRPA1和GPX4均上调（图3G-I）。上述结果提示，CA激活的TRPA1可以逆转HG介导的内皮细胞铁死亡。
接着，研究者进一步探索了
TRPA1对HUVEC增殖、迁移、管腔形成和细胞周期的影响。结果证实，在HG的影响下，EdU阳性细胞显著减少，处于S期的细胞减少。同时，在CA和Lip-1处理下，HG诱导的EdU阳性细胞减少被逆转（图4A-B），导致更多细胞处于S期（图4J-K）。上述结果表明细胞中新合成的DNA增加，证实CA减轻了HG对细胞增殖的抑制作用。Western blotting结果也表明，HG处理导致HUVEC中CyclinD1、CyclinD3和VEGF表达水平降低。同样，HG诱导的蛋白质表达降低可以通过用CA和Lip-1处理来抵消（图4C）。随后，研究者在划痕实验（图4D-E）和迁移实验（图4F、H）中也发现了类似的结果。成管实验结果显示，与 HG 组相比，CA 和 Lip-1 组在 HG 条件下表现出更多的分支和总分支长度，这表明 CA 可以减轻 HG 对 HUVEC 血管生成的有害影响（图4G、I）。总的来说，以上结果强调了 CA 激活的 TRPA1 减轻了 HG 诱导的 HUVEC 功能障碍。
随后，研究者进一步研究了
TRPA1如何抑制 HUVEC 中的铁死亡。在典型情况下，Nrf2 蛋白作为 Nrf2/Keap1复合物的一部分存在于细胞质中。然而，当 Nrf2 被激活时，它会从复合物中分离出来并移动到细胞核中，从而激活参与抗氧化和抗炎反应的各种基因。因此，研究者使用免疫荧光染色研究了 TRPA1 激活后 Nrf2 的核定位。在 CA 治疗组中， Nrf2 发生了显著的核易位（图5A）。WB结果显示，在 HG 环境中，核 Nrf2 减少，CA 诱导TRPA1 激活后核内 Nrf2显著增加，而细胞质中 Nrf2 无明显改变（图5B-D）。同样，研究者用 Nrf2 特异性抑制剂 ML385 显著降低了 TRPA1 激活下的核 Nrf2（图5A-D）。这些结果表明 Nrf2 介导下游 TRPA1 信号传导。
TRPA1是一种非选择性钙通道，研究者使用Ca
2+
探针
Fluo-4 AM发现 CA 显著增强了细胞内Ca
2+
的荧光强度，表明
CA可以激活TRPA1（图6A-B）。CA处理后CaMKII磷酸化水平显著升高，提示CA处理后CaMKII被激活（图6C-E）。ρ-CaMKII的竞争性抑制剂KN-93在CA激活后显著降低CaMKII磷酸化水平，同时显著降低Nrf2的核易位（图6C、G、I）。上述实验结果表明 Ca
2+
/CaMKII 介导的TRPA1激活直接影响 Nrf2 核易位。
CA 激活的 TRPA1 可通过抑制铁死亡来恢复内皮细胞功能。然而，局部注射 CA 容易丢失且难以在伤口部位维持，限制了其临床应用。为了实现 CA 向伤口的持续有效输送，研究者开发了一种可注射水凝胶，利用天然透明质酸 （HA） 和明胶 （Gel） 作为 CA 的载体。合成酰肼接枝明胶 （Gel-ADH） 和氧化透明质酸 （HA-CHO），然后将 CA 添加到 Gel-ADH 溶液中，通过双注射器将两种溶液等量混合，形成可适应各种伤口形状和大小的载 CA 水凝胶。随后，研究者对水凝胶的性能进行了表征。随着 HA-CHO 浓度的增加，水凝胶的孔隙密度增加 （图7A-B）。溶胀实验表明，随着 HA-CHO 浓度的增加，HA-gel 水凝胶的溶胀率降低 （图7C）。高溶胀率可增强吸收伤口渗出液的能力，并保证有效填充伤口。此外，流变力学测试显示不同浓度的 HA-CHO 对 HA-Gel 水凝胶的模量没有显著影响 （图7D）。基于此，研究者选择由 4% HA-CHO 和 16% Gel-ADH 组成的 HA-Gel 水凝胶作为合适的载体。剪切稀化性能测试表明HA-Gel 水凝胶可以在高应变和低应变之间循环，具有良好的自修复功能（图 7E）。明胶是基质金属蛋白酶 （MMP） 的明确底物。因此，研究者使用 MMP-9 在体外测试了 HA-Gel 水凝胶的降解性能（图7F）。结果表明，即使在较低浓度下，MMP-9 也加速了水凝胶的降解。因此 MMP-9 响应的 HA-Gel 水凝胶在炎症环境下会更快的降解并释放 CA。研究者进一步在体内和体外测试了 HA-gel 水凝胶的生物相容性。H&E 染色显示 HA-Gel 组的心脏、肺、肝、脾和肾没有组织学异常，表明水凝胶没有显著毒性（图7G），细胞活/死染色也无明显组间差异（图7H）。这些结果表明 HA-Gel 水凝胶具有出色的生物相容性。
最后，研究者探究了
CA激活的TRPA1是否能加速体内糖尿病伤口愈合。他们在糖尿病小鼠背部制造一个圆形全层皮肤缺损伤口（直径≈1cm），以PBS（DM组）、单独CA（DM+CA组）和单独HA-Gel（DM+HA-Gel组）作为对照。如图8A-C所示，在第3天观察时，用CA@HA-Gel（DM+CA@HA-Gel组）治疗的伤口与用PBS、CA和HA-Gel治疗的伤口相比明显缩小。在第14天，用CA@HA-Gel治疗的伤口面积减少了约95%，而用PBS、CA和HA-Gel治疗的伤口面积仅分别减少了46%、83%和51%。此外，研究者利用第7天和第14天的伤口H&E染色全景图来评估不同亚组的伤口大小（图8D和G）。结果显示，在CA@HA-Gel治疗组中，伤口大小在第7天缩小至约2毫米，第14天伤口几乎完全闭合。这些结果与图8A-C所示的大体伤口愈合图像、伤口闭合痕迹和定量分析一致。组织学分析表明，与其他组相比，CA@HA-Gel显
著
增加伤口组织中的胶原纤维沉积（图8E和H）。同时，WB结果显示添加CA显著增加Nrf2和GPX4蛋白的表达（图8F和K）。伤口GPX4的免疫组织化学染色与WB结果一致（图8I-J）。这些结果表明CA和CA@HA-Gel治疗可抑制糖尿病伤口铁死亡，而PBS和HA-Gel并不能减轻糖尿病伤口铁死亡。最后，研究者在第7天收集4组的伤口组织进行血管生成和胶原沉积检测。结果显示CA@HA-Gel治疗显著上调了CD31、α-SMA和COL1A1的表达。这些结果表明CA@HA-Gel治疗可促进糖尿病伤口新生血管形成。上述体内实验结果表明，CA@HA-Gel 的 CA 延长释放有可能通过抑制铁死亡和恢复伤口中的血管生成来增强糖尿病伤口的愈合。
综上所述，该研究阐明
TRPA1 是抑制糖尿病伤口愈合中内皮细胞铁死亡的重要候选因子。由CA 激活的 TRPA1 通过 Ca
2+
/CaMKII/Nrf2/GPX4 信号通路抑制内皮细胞铁死亡，从而增强内皮细胞迁移、增殖和管腔形成。同时，研究者们根据糖尿病伤口的特点设计了一种 MMP-9 响应的可注射双层混合水凝胶作为 CA 的载体，可有效填充不同形状创面并响应内容物的释放。本研究为加速糖尿病伤口的愈合过程提供了一种有前景的新型治疗方法。
该研究由武汉大学中南医院的胡汉昆教授团队、华中科技大学
同济医学院附属协和医院
的刘国辉教授团队、河北医科大学第三医院的侯志勇教授团队以及武汉市第四医院的夏平教授团队合作完成，并于
2024年9月发表于
Bioactive Materials
期刊。
文章信息：
Lin C, Hu Y, Lin Z, Du L, Hu Y, Ouyang L, Xie X, Cheng P, Liao J, Lu L, Zeng R, Xia P, Hou Z, Liu G, Hu H. MMP-9 responsive hydrogel promotes diabetic wound healing by suppressing ferroptosis of endothelial cells. Bioact Mater. 2024 Sep;
43:240-254.
供稿：季威
审校：夏婷婷
编辑：高仕杰
