郑刚教授：一种注射一次就可以持久降低胆固醇的新方法

Clinic門诊新视野 · 公众号 · 医学 · 2025-02-17 18:58

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作者：泰达国际心血管病医院郑刚

表观遗传编辑已成为一种在体外和体内调节基因表达的强大方法。在启动子区域的CpG二核苷酸位点诱导DNA甲基化已被证明在将基因持久锁定在沉默状态方面是有效的 ^[1-3] 。DNA甲基化是一种抑制性标记，通过DNA甲基转移酶（DNMT1）的活性在细胞分裂中持久且忠实地传播，DNMT1识别DNA复制引起的半甲基化状态，并将甲基恢复为新合成的胞嘧啶 ^[4,5] 。与依赖单链DNA断裂（缺口）的基因编辑方法（如碱基和引物编辑）或双链DNA断裂（切割）（如CRISPR-Cas9核酸酶编辑）不同，靶向表观遗传编辑不会破坏DNA序列的完整性，从而避免了与核酸酶编辑相关的潜在遗传毒性风险 ^[6-8] ，并且碱基和引物的编辑频率要低得多 ^[9] 。因此，表观遗传编辑是一种有前景的策略，可以通过靶向甲基化或去甲基化分别沉默或激活感兴趣的基因，当原发性DNA序列不需要改变。相比之下，碱基编辑和引物编辑是通过单核苷酸变化或靶向插入新的DNA序列来纠正与疾病相关的遗传变异的 ^[10-12] 。碱基编辑也被用于体内，通过引入无义突变或破坏外显子-内含子边界处的剪接位点来降低感兴趣基因的表达 ^[13-15] 。

使用可编程表观遗传编辑器（EE）在体外人类细胞中证明了持久的沉默，其中基因沉默持续了数月 ^[1,3] 。这些表观遗传编辑器由DNA甲基转移酶和基于KRAB的转录阻遏物结构域的组合组成，该结构域与DNA结合结构域融合为单个或多个融合蛋白 ^[1,3] 。尽管体内表观遗传编辑概念的初步证明表明，小鼠肝脏中的内源性Pcsk9基因会持续沉默 ^[2] ，但要验证表观遗传编码作为一种潜在可行的临床应用，需要在非人类灵长类动物（NHP）中证明其活性、持久性和安全性。

此外，尽管用于治疗靶点抑制的基因编辑和碱基编辑方法已在临床前物种 ^[14-19] 和人类 ^[20-22] 中得到证实，但体内逆转DNA序列这些变化的能力尚未发表，需要鉴定新的DNA靶向部分[即新的指导RNA（gRNA）]来解释这些变化。相比之下，设计用于去除CpG上甲基标记的表观遗传激活剂理论上可以在体内使用相同的靶向DNA结合结构域在相同的基因组位置部署在先前沉默的组织中，因为表观遗传编辑后的潜在DNA序列没有变化。

新近发表一项研究报告了一种针对人类PCSK9的EE的开发，用于在体内持久降低低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）水平。在携带人PCSK9基因组基因座的转基因小鼠和NHP中测量了靶向EE的PCSK9的活性、效力和持久性，而在原代人肝细胞中评估了特异性。在这项研究中，作者设计了一种表观遗传编辑器来靶向人类PCSK9，从而诱导该位点的DNA甲基化。单次施用包裹编码这种表观遗传编辑器的mRNA的脂质纳米颗粒就足以在转基因小鼠中几乎完全沉默人类PCSK9。沉默持续至少1年，并在部分肝切除诱导的肝再生后完全维持。此外，作者发现，在用旨在使PCSK9基因座去甲基化的靶向表观遗传激活剂治疗之前沉默的PCSK9小鼠后，表观遗传编辑具有可逆性。值得注意的是，在食蟹猴中，单次施用表观遗传编辑器可有效且持久地将循环PCSK9蛋白水平降低约90%，同时LDL-C水平降低约70%。这些发现证明了体内持久和可逆表观遗传编辑的治疗潜力，并支持基于表观遗传编辑器的高胆固醇血症治疗的发展 ^[23] 。

上述研究证明了表观遗传编辑在调节体内基因表达方面的潜在治疗应用。作者鉴定了一种靶向PCSK9的EE，该EE可重复地诱导PCSK9基因座的CpG甲基化特征，导致小鼠体内循环PCSK9蛋白几乎完全抑制，其功效与使用腺嘌呤碱基编辑器14-16和CRISPR Cas9的基因组编辑方法相似，但不需要产生单链或双链DNA断裂。尽管上述研究EE的总体架构与Cappelluti等 ^[2] 描述的相似，但PCSK9-EE-V2被开发为对人类PCSK9基因具有活性，并针对体内效力进行了广泛优化。值得注意的是，作者在啮齿动物中的发现扩展到了NHP，其中针对EE的PCSK9使循环PCSK9减少了约90%，导致血浆LDL-C显著降低（约70%）。研究的小鼠研究还表明，人类PCSK9基因的表观遗传编辑至少可持续1年。这些数据支持开发一种单剂量治疗高胆固醇血症的方法，其LDL-C的降低与需要长期给药的批准治疗方法[如PCSK9单克隆抗体 ^[24-25] 和小干扰RNA（siRNA） ^[26] 相当或更好。

目前的治疗算法建议，对于在最大耐受他汀类药物治疗中未达到LDL-C目标的患者，应添加PCSK9抑制剂 ^[27-28] 。重要的是，PCSK9抑制剂在添加到他汀类药物治疗中时进一步降低LDL-C的能力在包括小鼠 ^[29] 和NHPs ^[30] 在内的临床前实验中得到了证明，并在多种临床环境中得到了证实，而与实现血浆PCSK9降低的机制无关，如单克隆抗体 ^[25,31] 、RNA干扰（RNAi）治疗 ^[26] 或腺嘌呤碱基编辑器 ^[20] 。这表明，使用表观遗传编辑抑制PCSK9有可能降低LDL-C，作为他汀类药物的附加疗法。

开发针对EE的PCSK9的一个关键方面是确保我们的有效载荷足够有效，以在从小鼠到NHP的临床前测试中保持活性。事实上，使用siRNA或mRNA有效载荷的研究表明，与啮齿动物相比，在猴子的LNP药物产品测试中，效力大幅降低（约3~10倍） ^{[14-15,32-33]} 。研究的数据表明，可以在大约1 mg kg−1的剂量下达到最大的药理作用，这一剂量在猴子身上具有良好的耐受性。因此，实现足够的效力至关重要，因为基于LNP的疗法具有狭窄的治疗指数，当药物活性剂量与观察到不良事件的剂量之间几乎没有分离时，这可能会阻碍临床开发。

与其他基因组编辑技术相比，在不改变基础DNA序列的情况下，基因表达的持久变化是表观遗传编辑的一个潜在安全优势 ^[1,3] 。使用CRISPR-Cas9等传统基因编辑方法引入双链DNA断裂可能会导致染色体畸变，包括大缺失、重排或染色体畸变 ^[6-8] 。此外，最近使用DNA结合结构域的编辑技术，如碱基编辑和素数编辑，依赖于单个碱基断裂（或缺口）来最终调节基因表达，并不能完全免除潜在的遗传毒性效应，当两个或多个基因同时被靶向时，这种效应可能会进一步加剧 ^[9] 。相比之下，我们的PCSK9靶向EE使用了一种催化无活性的Cas9蛋白，不能产生DNA断裂 ^[34-36] ，从而避免了任何与治疗相关的染色体异常风险。尽管对EE的特异性评估表明，PCSK9基因座以外的少数基因组区域存在差异甲基化，但这些变化与基因表达的显著改变无关。此外，研究的EE在PCSK9位点的靶向甲基化具有高度的可重复性，在启动子区域被限制在约1.5 kb的窗口内，并在细胞分裂过程中得到忠实的维持，正如在经历PHx的小鼠中所证明的那样，成熟肝细胞重新进入细胞周期，使肝脏再生到正常大小。

在获得表观遗传编辑后保存DNA序列的另一个优点是，使用与包含Tet酶的脱甲基化结构域融合的相同靶向剂具有可逆性，Tet酶是一种甲基胞嘧啶双加氧酶，有助于甲基化CpGs43的脱甲基。作为概念的初步证明，能够快速重新激活PCSK9基因座，并恢复之前用研究的PCSK9靶向EE治疗的小鼠的正常血浆PCSK9水平。这是通过使用一种构建体实现的，该构建体旨在去除CpG二核苷酸上的甲基标记，该标记与最初用于甲基化PCSK9位点的相同PCSK9靶标gRNA配对。尽管与PCSK9等临床验证的靶点相关性较低，但当与特定靶点的持久沉默相关的安全性特征未完全阐明或不再需要靶点抑制时，这种方法可能有用。

小结

上述研究描述了针对PCSK9的EE治疗高胆固醇血症的开发，该药物具有持久性、特异性和可逆性，值得注意的是，它具有足够的效力，可以继续向临床评估发展。在开始临床试验之前，需要进一步评估针对PCSK9的EE的疗效、耐受性和安全性，包括额外的体内研究，以评估药品的药效学和药效学特性及其生物分布和潜在的毒理学效应。最终，针对EE的PCSK9有可能成为一种一劳永逸的治疗方法，打破目前降低LDL-C的治疗范式，确保在慢性治疗依从性极低的患者群体中终身降低心血管风险。因此，表观遗传编辑代表了一种有前景的体内基因调控治疗方法。

参考文献

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