华人科学家开发改进版的多重置换扩增方法

生物通 · 公众号 · · 2017-08-04 17:11

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多重置换扩增（MDA）是一种等温扩增方法，常常用于全基因组的扩增。MDA与新一代测序（NGS）的结合使用，已成为现在基因组研究的金标准方法。不过，MDA往往存在模板无关的扩增。为了解决这个问题，美国圣路易斯大学医学院的研究人员对MDA操作进行了改进。他们的成果发表在《BioTechniques》上。

这篇文章的通讯作者之一是圣路易斯大学医学院的Xiaofeng Fan副教授。他早年毕业于南京医科大学，2000年进入圣路易斯大学健康科学中心工作。他主要研究丙型肝炎病毒的分子病毒学，以及发现新的病原体和疾病的生物标志物。

多重置换扩增广泛用于基因组或转录组的扩增。它通常使用phi29 DNA聚合酶，这种酶表现出出色的链置换和核酸外切酶活性。因此，MDA在模板覆盖度和扩增保真度上都优于PCR方法。此外，链置换扩增带来了高分子量（≥10kb）的产物，这特别适合NGS的文库构建。基于这些原因，MDA与NGS常常配合使用。

然而，MDA也长期存在一个问题，那就是模板无关的扩增（template-independent amplification，TIA），特别是在扩增超低浓度的模板时。阴性对照中TIA引起的阳性扩增不仅破坏了实验结果的可信度，更重要的是，产生了垃圾DNA。在某些研究中，即使MDA经过全面优化，垃圾DNA可能也占了70%。

于是，人们采用种种手段来消除垃圾DNA，但这些方法均没有广泛采用。许多商业化试剂盒建议，增加模板量（≥10ng）并缩短孵育时间，以便最大程度避免TIA，不过，许多研究往往达不到这样的样本量。

为此，圣路易斯大学的研究团队使用5’端封闭的随机五聚体引物，开发出一种可靠的MDA操作方案。这种等温扩增仅仅以模板依赖的方式进行，因此被命名为tdMDA（template-dependent）。他们利用这种方案对人类循环RNA进行了有效扩增，从而证明了tdMDA的潜力。

研究人员采集了30份血清样本，从0.2 mL样本中提取出RNA，接着利用多种方法来去除残留的基因组DNA。然后，他们利用5’端封闭的随机五聚体引物来开展逆转录和MDA，以便消除模板无关的扩增。利用扩增产物构建测序文库之后，他们在Illumina的NextSeq 500测序平台上开展测序。

研究结果表明，与常规MDA相比，tdMDA处理后阴性对照中可定量的DNA扩增明显减少，这反映为Illumina测序中无法比对的序列减少（7 ± 10.9% vs. 58.6 ± 39%），而血清转录组的比对率增加（26.9 ± 7.9% vs. 5.8 ± 8.2%）。转录组图谱可以将慢性丙型肝炎病毒（HCV）感染的患者与HCV相关的肝细胞癌（HCC）患者区分开来。

作者总结道，他们开发出一种简单而可靠的解决方案，可消除MDA中的模板无关扩增。利用tdMDA，他们证明0.2 mL患者血清也能实现循环RNA的有效分析。肝炎和肝癌患者的转录组图谱差异进一步证明了tdMDA有望应用于液体活检。